李小梅，鹿 偉，杜錦輝

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

胃潰瘍是一種臨床常見的胃黏膜功能受損、胃組織病理出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的多發(fā)性消化系統(tǒng)疾病。胃潰瘍可發(fā)生潰瘍出血、幽口梗阻、貧血及潰瘍穿孔等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康[1-2]。目前，臨床常用殺菌、抑酸及保護(hù)胃黏膜等西藥治療胃潰瘍，但治療效果不佳，復(fù)發(fā)率高，長期服用甚至出現(xiàn)耐藥性，因此胃潰瘍的治療仍是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一大問題[3-4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃潰瘍是由于正氣虛弱、脾胃功能不足、脾胃自虛而引發(fā)的胃脘痛，而脾胃虛寒被認(rèn)為是在各種胃潰瘍類型中最為常見和高發(fā)的一種類型[5]。脾胃虛寒型胃潰瘍主要病機(jī)為脾胃虛弱為本，瘀熱內(nèi)阻為標(biāo)，實(shí)乃本虛標(biāo)實(shí)、氣血逆亂瘀滯之證，故中醫(yī)常以行氣活血，溫中散寒治療[6]?！短交菝窈蛣┚址健酚杏涊d“六和湯治心脾不調(diào)，氣不升降，寒熱交作，并傷寒陰陽不分，冒暑伏熱煩悶，或成痢疾，并宜服之”。由此可見六和湯有健脾祛濕、升清降濁之功效[7-8]。因此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討了六和湯對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，以期為胃潰瘍的治療提供新方法和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康狀況良好的SPF級(jí)SD雄性大鼠52只，4周齡，體質(zhì)量80～100 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2016-0002。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度為18～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%，自由飲水飲食，所有大鼠均采用斷頸法進(jìn)行處死，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 番瀉葉購于北京同仁堂藥店（批號(hào)：180104002），番瀉葉水煎劑制備方法為1 g番瀉葉加入5 mL去離子水文火熬煮30 min，過濾藥液，同樣方法熬煮3次后合并藥液，4℃保存?zhèn)溆谩Ａ蜏幬锝M成：白術(shù)15 g，茯苓15 g，人參10 g，半夏10 g，三七10 g，杏仁10 g，木瓜6 g，砂仁6 g，黃連6 g，木香6 g，甘草6 g。上述藥材加10倍量水煎煮40 min，過濾后在藥渣中加入8倍量水繼續(xù)煎煮30 min后，過濾，將文火熬煮2次后的藥液合并，兌入適宜的食用糖，并加熱直至糖融化，4℃保存?zhèn)溆?。阿司匹林腸溶片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：018150593）研磨后溶于去離子水中制成混合液，灌胃劑量為200 mg/kg。IL-6酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（貨號(hào)：K4145-100）、TNF-α酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（貨號(hào)：K1052-100）（美國Biovision公司）；MDA試劑盒（貨號(hào)：A003-1）、SOD試劑盒（貨號(hào)：A001-1-1）（南京建成工程研究所）；p-p38 MAPK兔抗鼠單克隆抗體（貨號(hào)：9216S）、p-JNK兔抗鼠單克隆抗體（貨號(hào)：9255S）（美國Cell Signaling Technology公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：A0208）。

1.3 主要儀器MNT-150T型游標(biāo)卡尺（德國美耐特公司）；Cytation3型酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司）；Leica EG1150型組織包埋機(jī)（德國徠卡公司）；RM2235型組織切片機(jī)（德國徠卡公司）；PowerPac型電泳儀（美國BIO Rad公司）；1703940型轉(zhuǎn)膜儀（美國BIO Rad公司）。

1.4 造模與分組52只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)取13只大鼠作為正常對(duì)照組，其余39只大鼠，采用苦寒瀉下和游泳力竭法建立脾胃虛寒型大鼠模型[5]，用番瀉葉水煎液（1 g/mL）對(duì)造模大鼠進(jìn)行灌胃，2 h后將各組大鼠放入裝有常溫自來水的50 cm深的水槽中游泳，使其整體沒入水中3 s后立即撈起，連續(xù)7 d建立脾胃虛寒模型。第8天起對(duì)各組大鼠灌胃給予無水乙醇，1 h后再次灌胃給予阿司匹林（0.2 g/kg），連續(xù)5 d，建立脾胃虛寒胃潰瘍大鼠模型，造模期間大鼠共死亡6只，隨機(jī)取正常對(duì)照組及造模組大鼠各3只，病理切片結(jié)果顯示造模組大鼠胃黏膜組織出現(xiàn)胃黏膜結(jié)構(gòu)受損，皺皮增厚，出現(xiàn)潰瘍、上皮細(xì)胞脫落及大量炎癥細(xì)胞浸潤的情況，則判斷造模成功。造模成功后，將存活的30只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、六和湯高劑量組和六和湯低劑量組，每組10只。

1.5實(shí)驗(yàn)給藥 灌胃方式給藥，六和湯方中總生藥量為100 g，根據(jù)人與大鼠體表面積計(jì)算公式得出大鼠每日生藥量=總生藥量/成人體質(zhì)量（60 kg）×6.3，六和湯高、低劑量組大鼠分別灌胃給予六和湯42、10.50 g/kg，正常對(duì)照組和模型組灌胃等量冷開水，1次/d，連續(xù)14 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般癥狀和體征 實(shí)驗(yàn)期間，每天09:00:00定時(shí)觀察各組大鼠一般情況（如活動(dòng)狀態(tài)、大便及毛發(fā)光澤度等情況），每周記錄大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食和飲水情況并檢測(cè)肛溫。

1.6.2 胃黏膜潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率測(cè)定 電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠胃黏膜潰瘍和糜爛部分，并采用Guth法計(jì)算其潰瘍指數(shù)和抑制率[9]。潰瘍抑制率（%）=[（模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù)）/模型組潰瘍指數(shù)]×100%。（見表1）

表1 潰瘍指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.3 大鼠血清中炎癥因子（IL-6、TNF-α）和氧化應(yīng)激指標(biāo)（MDA、SOD）的檢測(cè) 給藥結(jié)束后，麻醉各組大鼠，腹主動(dòng)脈采血，在4℃離心條件下，12 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?yán)格按照試劑盒說明書對(duì)血清中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.4 大鼠胃黏膜組織病理切片 取出大鼠胃組織，生理鹽水漂洗、濾紙吸干，轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛溶液浸泡固定48 h，脫水、包埋、切片、HE染色，鏡下觀察大鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6.5 Western blotting法檢測(cè)胃組織MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 常規(guī)方法提取胃組織蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入β-actin一抗（1∶1 000）、p-JNK一抗（1∶1 000）、p-p38 MAPK一抗（1∶1 000），37℃，搖床搖勻4 h，1×TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（1:5 000），室溫孵育1 h，1×TBST洗滌3次，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，得到p-p38 MAPK、p-JNK條帶，根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，方差齊采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 正常對(duì)照組大鼠動(dòng)作反應(yīng)靈敏，大便正常，體質(zhì)量正常。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，易扎堆聚集，大便較稀，體質(zhì)量下降，肛溫下降（P＜0.05）；與模型組比較，六和湯高、低劑量組大鼠便稀、扎堆聚集狀況得到緩解，體質(zhì)量和肛溫明顯增加（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠肛溫明顯升高（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠體質(zhì)量及肛溫變化（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量及肛溫變化（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與六和湯低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg） 體質(zhì)量（g） 肛溫（℃）正常對(duì)照組 10 - 288.54±14.87 37.99±0.07模型組 10 - 232.33±13.71a 36.50±0.18a六和湯高劑量組 10 42.00 266.17±8.70b 37.55±0.16bc六和湯低劑量組 10 10.50 256.79±9.49b 37.30±0.15b

2.2 各組大鼠胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較 模型組大鼠潰瘍指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠潰瘍指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠胃潰瘍指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。六和湯高劑量組潰瘍抑制率為71.62%，六和湯低劑量組潰瘍抑制率為61.99%，提示六和湯對(duì)胃潰瘍具有良好的抑制作用，高劑量的六和湯治療效果優(yōu)于低劑量六和湯。（見表3）

表3 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理變化 正常對(duì)照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，無上皮細(xì)胞脫落、潰瘍和炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)潰瘍、上皮細(xì)胞脫落及大量炎癥細(xì)胞浸潤的情況；六和湯高劑量組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞脫落情況得到顯著改善，六和湯低劑量組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤得到改善，但大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)存在一定的缺損，上皮細(xì)胞部分脫落。（見圖1）

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理變化（HE，×100）

2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6含量明顯低于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠血清TNF-α明顯降低（P＜0.05）。提示六和湯可降低炎癥水平，高劑量六和湯效果更好。（見圖2）

圖2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量比較（±s，n=10）

2.5 各組大鼠血清MDA、SOD含量比較 模型組大鼠血清MDA含量明顯高于正常對(duì)照組，而SOD含量明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠血清MDA含量明顯低于模型組，而SOD含量高于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠血清MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高（P＜0.05）。提示六和湯可降低氧化應(yīng)激水平，高劑量六和湯效果更好。（見圖3）

圖3 各組大鼠血清MDA、SOD含量比較（±s，n=10）

2.6 各組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)情況比較 模型組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；六和湯高、低劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05）；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。提示六和湯可抑制MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，高劑量六和湯效果更好。（見圖4）

圖4 各組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)情況比較（±s，n=10）

3 討 論

胃潰瘍患者常見的臨床癥狀為胃部疼痛或不適、胃脹和胃酸等，若治療不及時(shí)可引發(fā)胃穿孔等而威脅患者生命。中醫(yī)把胃部綿綿作痛或絞痛或者脹氣痛歸屬“胃脘痛”的范疇。胃脘痛和人體自身的正氣有關(guān)，寒邪犯胃或熱邪犯胃都可以導(dǎo)致胃脘痛。六和湯中白術(shù)、茯苓、人參和甘草為四君子湯，有健脾益氣之功效；半夏和杏仁味辛，有燥濕理脾的作用；木瓜與黃連起到溫清除濕的效果；砂仁、木瓜及木香可起抑肝和胃、行氣化濕、舒暢氣機(jī)之功效；三七粉具有活血止痛、祛除血分瘀滯的作用。諸藥合用，共奏健脾治本、除濕理氣、行血之功[10]。

本研究中脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠反應(yīng)遲鈍，扎堆聚集，大便較稀，體質(zhì)量下降，肛溫下降。六和湯干預(yù)后，六和湯高、低劑量組大鼠便稀、扎堆聚集狀況得到緩解，體質(zhì)量和肛溫明顯增加，且潰瘍指數(shù)均低于模型組大鼠，六和湯高劑量組潰瘍抑制率達(dá)到71.62%，六和湯低劑量組潰瘍抑制率為61.99%。胃黏膜組織病理學(xué)檢查顯示，模型組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)潰瘍、上皮細(xì)胞脫落及大量炎癥細(xì)胞浸潤的情況；六和湯高劑量組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞脫落情況得到顯著改善；六和湯低劑量組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤得到改善，部分上皮細(xì)胞脫落。與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠肛溫明顯升高、潰瘍指數(shù)明顯降低。上述研究結(jié)果提示六和湯對(duì)胃黏膜有一定的保護(hù)作用，對(duì)胃潰瘍有良好的抑制作用，高劑量六和湯的治療效果優(yōu)于低劑量六和湯。另外，病理結(jié)果提示，炎癥可能參與了胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展。

胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展與胃黏膜侵襲因素和防御機(jī)理之間平衡密切相關(guān)。胃黏膜損傷修復(fù)過程涉及多種細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等[11]，其中炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是引起胃潰瘍發(fā)生的重要因素[12-13]。IL-6為誘發(fā)炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞生長和分化的趨化因子，可招募大量的炎癥細(xì)胞，增加炎癥因子水平[14]。TNF-α為單核細(xì)胞分泌，是機(jī)體損傷時(shí)早期出現(xiàn)的炎癥因子[15]。IL-6和TNF-α在胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制和治療中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]。血清MDA是氧化損傷產(chǎn)物，SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，MDA和SOD的檢測(cè)可準(zhǔn)確反映機(jī)體的氧化應(yīng)激情況，SOD含量越高，MDA含量越低，提示潰瘍程度越輕[17]。大量的人群流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示，炎癥因子（IL-6、TNF-α）和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（MDA、SOD）水平與胃潰瘍發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18-20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠IL-6、TNF-α、MDA含量明顯增加，SOD含量明顯降低。六和湯干預(yù)后，與模型組比較，六和湯高、低劑量組大鼠IL-6、TNF-α、MDA含量明顯降低，SOD含量明顯增加；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠血清TNF-α、MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高，說明六和湯能夠降低脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)和氧化損傷，對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠起到保護(hù)作用，高劑量六和湯對(duì)改善脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)和氧化損傷效果更好。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一組結(jié)構(gòu)內(nèi)包含p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶及細(xì)胞外調(diào)控結(jié)構(gòu)的蛋白激酶家族。p38 MAPK信號(hào)通路可被不良刺激如活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）激活并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21]。DIAO S L等[22]在探討藏紅花對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的影響發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清SOD水平降低，MDA、IL-6、TNF-α水平，以及p38 MAPK的磷酸化水平明顯升高，且炎癥因子水平與p-p38 MAPK密切相關(guān)，而藏紅花能減輕動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂異常的作用機(jī)制可能與其抗氧化、下調(diào)p-p38 MAPK和抗炎作用有關(guān)。另有研究也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在干預(yù)靶點(diǎn)[23]。鞏子漢等[24]發(fā)現(xiàn)白及多糖可下調(diào)JNK及p38 MAPK，抑制TNF-α、IL-6異常分泌從而對(duì)胃黏膜發(fā)揮保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，六和湯高、低劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組；與六和湯低劑量組比較，六和湯高劑量組大鼠胃黏膜組織p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)明顯降低。由此可見，MAPK信號(hào)通路參與了脾胃虛寒型胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展，六和湯可通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路對(duì)其發(fā)揮保護(hù)作用，且高劑量六和湯效果更好。

綜上，六和湯能夠降低脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制MAPK信號(hào)通路有關(guān)，且高劑量六和湯效果更好。