白瑪央宗 玉珠拉姆 白瑪拉珍 馬超**

（1.西藏自治區(qū)高原生物研究所；2.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

甘青青蘭(Dracocephalum tanguticum)又名唐古特青蘭，是唇形科多年生草本植物，主要分布在青藏高原及其毗鄰區(qū)域，在西藏地區(qū)廣泛分布，常在干燥河谷的河岸、田野、草灘或松林邊緣生長，海拔1900～4000m［1,2］，實際分布海拔大于4000m。甘青青蘭作為常用藥材廣泛應(yīng)用于藏藥中，300 多種常用藏藥復(fù)方或制劑中將近三分之二包含甘青青蘭［3］。同時，因具有特殊的香味，在西藏地區(qū)也作為民間常用植物香料。

據(jù)文獻記載，甘青青蘭的化學(xué)成分主要有黃酮類、萜類、多糖及揮發(fā)油等，其中黃酮類化合物主要包括：胡麻苷、茵芋苷、大波斯菊苷、(R,S)-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,3',4'-三羥基-6,7-二甲氧基黃酮、5,6,4'-三羥基-7-甲氧基黃酮、5,4'-二羥基-6,7-二甲氧基黃酮-4'-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,4'-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮、條葉薊素-4-葡萄糖、胡麻苷-6'-乙酸酯、β-胡蘿卜苷等［4-6］，王敏等對其提取工藝進行了優(yōu)化［7］；萜類化合物主要包括：齊墩果酸及其衍生物、熊果酸及其衍生物、羽扇豆烷及其衍生物、白樺酯醇、α-香樹脂醇、烏發(fā)醇、齊墩果烷等［2-3］；酯類鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸-雙(2-乙基庚)酯等［8］；苯丙素類綠原酸甲酯及2,3-2H-3-羥基-咖啡酸甲酯［9］；酚酸類迷迭香酸及其酯化物［10］，同時還含有豐富的多糖［11-12］及揮發(fā)油［13-14］等。

甘青青蘭作為常用藏藥材，傳統(tǒng)上用花期地上部分，為更好的研究甘青青蘭揮發(fā)性熏香組分，筆者對花期采集于西藏自治區(qū)日喀則市康馬縣的甘青青蘭（平均海拔4300m），采用頂空-固相微萃取揮發(fā)性組分并用氣相色譜-質(zhì)譜分析測定（HS-SPME-GC-MS）其揮發(fā)性組分。同時，對樣品建立以ITS2和rbcL的分子標(biāo)記，為甘青青蘭資源的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年8 月，筆者赴西藏自治區(qū)日喀則市康馬縣采集甘肅青蘭，為盛花期甘青青蘭地上部分，樣品陰干處理（西藏日喀則宏康扶貧開發(fā)有限公司組織當(dāng)?shù)卮迕癫杉晌鞑刈灾螀^(qū)高原生物研究所馬超副研究員鑒定。

1.2 儀器與試劑

GC-MS安捷倫7890A-7000C；高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器FW100；磁力攪拌器北京大龍MSH-Pro；微固相萃取Supelco 50/30um,DVB/CAR/PDMS；萬分一天平SARTORIUS MSE224S；振蕩器上海比郎TYXH-I；植物DNA提取試劑盒索萊寶。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-SPME 條件。取2.0g 樣品加入到50mL 頂空瓶中，加入10mL 煮沸蒸餾水，立即密封頂空瓶。將樣品瓶置于60℃水浴中平衡15min，插入裝有纖維頭的手動進樣器，萃取40min 后，取出萃取頭插入GC 進樣口中于250℃解吸附3min，拔出萃取頭的同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)。萃取頭：50/30 DVB/CAR/PDMS 萃取頭。

1.3.2 DNA 提取及引物信息。取0.2g 粉碎樣品在液氮中磨細后采用天根植物DNA提取試劑盒進行提取，采用引物（表1）為分別擴增ITS2 及rbcL 片段，由北京美吉生物醫(yī)藥科技股份有限公司測序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索。

表1 甘青青蘭DNA擴增引物信息

1.3.3 GC-MS條件

1.3.3.1 氣相色譜（GC）條件：HP-5MS（60m×0.32mm×0.25μm）石英毛細管柱；進樣口溫度250℃，載氣為高純氦氣＞99.999%，流速1.0mL/min；無分流進樣；色譜柱升溫程序：初始溫度50℃，保持2min，以5℃/min 升至250℃，保持3min，以10℃/min 升至300℃，運行時間為50 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件：離子源為EI 源，離子源溫度250℃，電離能量70eV；四極桿溫度150℃；接口溫度280℃；質(zhì)量掃描m/z為40～600。通過Nist11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫檢索，采用峰面積歸一化法進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定

將測得的樣品序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行Blast比對，顯示其ITS2 序列相似度最高（96%）的為青蘭屬百花梔子花（KF041167.1），而rbcL 序列相似度最高（99%）的為甘青青蘭（MT457746.1），結(jié)合樣品形態(tài)鑒定確定樣品為甘青青蘭。兩段序列已上傳至Gen‐Bank，登錄號分別為MW889005、MW915538。

2.2 揮發(fā)性成分檢測

采用HS-SPME-GC-MS 提取分析甘青青蘭揮發(fā)性成分，將樣品譜圖與NIST 指紋庫進行比對,一共鑒定出了93 種化合物（表2）。經(jīng)過面積歸一化分析,所有鑒定出來的化合物占所有色譜峰總面積的99.52%.主要揮發(fā)性成分為反-松香芹乙酯（12.20%）、羅勒烯（12.18%）、N［（1S,2S）-2-氨基環(huán)己基］-N’-［3,5-雙（三氟甲基）苯基］-硫脲（4.95%）、（4R，5S）-5-乙烯基-5-甲基-4-（1-甲基乙烯基）-2-（1-甲基亞乙基）-環(huán)己酮（4.45%）、月桂烯（3.38%）、欖［香］醇（3.12%）等。

表2 甘青青蘭揮發(fā)性成分及其相對含量

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

2.3 主要揮發(fā)性成分含量對比

王鋼力［15］、利毛才讓［13］、徐中海［3］、黃小平［14］對產(chǎn)區(qū)為青海、青海、西藏、四川的甘青青蘭，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性組分，并用GC-MS 及峰面積歸一化法測定相對含量。將以上四個樣品與康馬縣樣品的8 種主要成分及其含量對比（表3），發(fā)現(xiàn)康馬縣采集的甘青青蘭中有含量較高的反-松香芹乙酯和羅勒烯，王鋼力的樣品含有高含量的桉油精和N-乙基對甲苯胺，利毛才讓的樣品中發(fā)現(xiàn)極高含量的反-松香芹乙酯，其中羅勒烯、N-乙基對甲苯胺并未在其他樣品中測得，該結(jié)果顯示在樣品的化學(xué)組成和其含量上，不同地區(qū)樣品間存在較大的差異。

表3 不同產(chǎn)地甘青青蘭的主要揮發(fā)性成分含量對比

3 討論

甘青青蘭廣泛應(yīng)用于藏藥中，根據(jù)文獻發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)甘青青蘭采用水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)性成分含量存在較大的差異，對比西藏花期甘青青蘭采用固相微萃取提取揮發(fā)性組分通過GC/MS 分析發(fā)現(xiàn)桉油精均被檢測到，α-蒎烯、月桂烯、T-杜松醇、反-松香芹乙酯也有較高的檢出率，但幾種物質(zhì)在含量上存在較大差異，鑒于植物的采集時期（苗期或花期）、處理和貯存方法和時間的差異，同時還有地域的區(qū)別，都可能導(dǎo)致最終檢測結(jié)果的差異。藥材是一種特殊的商品，在其質(zhì)量上應(yīng)具有化學(xué)成分的同一性。盡管在藏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)上進行了大量的基礎(chǔ)研究，仍存在用藥部位不清，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)適用寬泛且簡單等的問題［16-17］，甘青青蘭作為藏醫(yī)藥常用藥材，在用藥上還需統(tǒng)一認識，確定其藥用部位，建議從采集加工源頭上規(guī)范采集，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，同時開展不同地區(qū)協(xié)同研究，進行該藥材的道地性評價。