馬媛，楊洋，陳書強(qiáng)，王曉紅*

(1.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038；2.西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710004)

輔助生殖技術(shù)(ART)是指以治療不孕不育癥為目的而采取的在體外操作配子及胚胎的治療手段或方法，主要包括胚胎體外培養(yǎng)、體外受精、胚胎冷凍解凍技術(shù)等。但是，由于體外環(huán)境和體內(nèi)的生理環(huán)境具有極大的不同，目前體外條件仍無法完全模擬體內(nèi)環(huán)境。況且，胚胎早期尚不具備屏障和保護(hù)功能。因此，體外培養(yǎng)環(huán)境會給配子及胚胎造成環(huán)境應(yīng)激，影響胚胎的發(fā)育潛能。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，胚胎體外培養(yǎng)可影響小鼠囊胚的發(fā)育，降低囊胚的著床率，影響后期胎鼠的宮內(nèi)生長[1]。而造成囊胚發(fā)育及胚胎存活率下降的相關(guān)機(jī)制目前尚不明確。

在生命活動進(jìn)行時，維持基因組穩(wěn)定需要DNA精確的復(fù)制和遺傳。DNA的完整性是保障胚胎發(fā)育、胚胎種植甚至子代健康的基礎(chǔ)[2]。如果DNA遭受到內(nèi)源性或外源性刺激，可引起DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期阻滯以及DNA損傷修復(fù)等。其中，DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)對基因組完整性以及后續(xù)的細(xì)胞存活具有嚴(yán)重的影響[3]。既往研究顯示，ART中多個步驟會導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)一步影響配子的質(zhì)量、胚胎發(fā)育甚至胎兒發(fā)育[4-6]。故本研究從DNA損傷為出發(fā)點，研究體外培養(yǎng)環(huán)境對小鼠囊胚DSBs的影響，為體外培養(yǎng)技術(shù)影響囊胚發(fā)育的潛在機(jī)制研究提供思路與方向。

材料與方法

一、實驗動物

清潔級ICR小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(批號：61001700003690)。雌鼠4～6周齡，雄鼠3～6月齡，普通小鼠飼料喂養(yǎng)。

二、主要試劑和儀器

1.試劑：胚胎培養(yǎng)采用KSOM培養(yǎng)液(Millipore，美國)，微量胚胎cDNA線性擴(kuò)增使用REPLI-g WTA Single Cell Kit(Qiagen，德國)；熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自日本Takara公司，γH2AX一抗為兔單克隆抗體(ab81299)購自英國Abcam公司，免疫熒光二抗為驢抗兔抗體(A21206)購自美國invitrogen公司，Hoechst 購自美國Sigma公司(Hoechst 33258 solution)。

2.儀器：實體解剖鏡(廈門，Motic)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，培養(yǎng)皿(35 mm)(Nunc，丹麥)，超凈臺(Labconco，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

三、研究方法及分組

1.小鼠模型建立及胚胎收集：雌鼠隨機(jī)分配為兩組，每組各6例。(1)自然交配組(Natural conception組，NC組)：將發(fā)情雌鼠與雄鼠1∶1自然合籠，次日檢查陰栓，見栓即為交配成功，當(dāng)日計為0.5 d，于3.5 d處死見栓雌鼠取雙側(cè)子宮，PBS沖洗獲得囊胚；(2)體外培養(yǎng)組(In vitro culture組，IVC組)：將發(fā)情雌鼠與雄鼠1∶1自然合籠，次日檢查陰栓，見栓當(dāng)日處死見栓雌鼠，于輸卵管取受精卵，用0.3%透明質(zhì)酸酶消化受精卵周圍顆粒細(xì)胞，然后將消化分離的受精卵多次沖洗，轉(zhuǎn)入KSOM溶液中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的3.5 d收集囊胚期胚胎。最終每組各獲得囊胚60枚用于后續(xù)分析。

2.實時定量PCR檢測：選擇每組囊胚20枚進(jìn)行微量胚胎cDNA線性擴(kuò)增，嚴(yán)格按照說明書要求操作。根據(jù)實時定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系，反應(yīng)總體系為20 μl：SYBR Green 10 μl，PCR特異上、下游引物按1∶1混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，滅菌蒸餾水7 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個cycle；72℃ 2 min。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列來自PrimerBank，詳見表1、2。每次檢測設(shè)定3個復(fù)孔，每個樣本重復(fù)3次。以上在每個PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號，PCR反應(yīng)完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值)，使用 2-ΔΔCt法計算各組中目的基因的表達(dá)情況。

表1 囊胚發(fā)育潛能相關(guān)基因引物序列

表2 DNA損傷相關(guān)基因引物序列

3.胚胎免疫熒光檢測及分析：采用免疫熒光法檢測每個囊胚γH2AX的表達(dá)情況，從而分析其DNA損傷的程度。以下每兩個操作步驟之間均需用含有0.1%聚乙烯醇(PVA)的PBS洗滌囊胚3次。收集兩組囊胚各40例，4%多聚甲醛室溫固定2 h，加入0.2%Triton-X打孔30 min，封閉液室溫封閉2 h，加入一抗(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜；次日，將囊胚加入488標(biāo)記的抗兔熒光二抗(1∶500稀釋)，避光孵育2 h，用含有10 μg/ml Hoechst 的PBS室溫避光染核30 min，PBS洗滌干凈后，封片，熒光顯微鏡照相。熒光亮度采用軟件Image J進(jìn)行分析，選取目標(biāo)區(qū)域，分析該區(qū)域平均光密度水平，并計算出同一樣本Hoechst染核的平均光密度。γH2AX的平均光密度值與核的平均光密度值的比值即為本樣品的實際平均光密度值。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、體外培養(yǎng)對囊胚早期發(fā)育的影響

通過對囊胚中多能因子和早期細(xì)胞定向分化因子的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，IVC組的多能因子Pou5f1、Nanog基因表達(dá)下降(P<0.05)，滋養(yǎng)層細(xì)胞分化相關(guān)分子Tead4的基因表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，滋養(yǎng)層細(xì)胞分化相關(guān)分子Cdx2、Eomes和Elf5的基因表達(dá)均顯著下降(P<0.05)，調(diào)控原始外胚層分化的基因Gata6、Sox17、Fgfr2以及Fgfr4在IVC組表達(dá)下降(P<0.05)。與NC組比較，IVC組中Lif基因也顯著下降(P<0.05)(表3)。

表3 兩組囊胚中發(fā)育潛能基因表達(dá)比較(-±s)

二、體外培養(yǎng)對囊胚DNA損傷的影響

與NC組的γH2AX相對熒光密度(0.558±0.560)比較，IVC組的γH2AX相對熒光密度(0.614±0.092)顯著升高(P<0.05)(圖1、2)。

γH2AX：γH2AX染色；Hoechst：細(xì)胞核染色；Merge：γH2AX與Hoechst重合后的顯像圖1 兩組囊胚免疫熒光檢測圖像(×200)

注：與NC組比較，*P<0.05圖2 體外培養(yǎng)對囊胚中γH2AX表達(dá)的影響

三、體外培養(yǎng)對囊胚DNA損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

與NC組比較，IVC組的DNA損傷相關(guān)基因Fas、Gadd45a和Ddit3的表達(dá)顯著上升(P<0.05)(表4)。

表4 體外培養(yǎng)對囊胚DNA損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響(-±s)

討 論

在胚胎發(fā)育早期，一些影響胚胎生長發(fā)育及分化的調(diào)控基因的突變，可以導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，決定胚胎的命運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)環(huán)境可影響小鼠囊胚多個命運(yùn)決定因子的表達(dá)。這些因子中，Pou5f1、Nanog和Sox2可以維持囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的多能性，使小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分化成上胚層和原始內(nèi)胚層[7]；而Cdx2、Eomes和Elf5可調(diào)控囊胚分化。Cdx2有利于保持囊胚期外滋養(yǎng)層細(xì)胞的完整性[8]。Eomes參與滋養(yǎng)層細(xì)胞的命運(yùn)走向，當(dāng)敲除Eomes基因后，胚胎可以發(fā)育成形態(tài)看似正常但發(fā)育停滯的囊胚[9]。Elf5可進(jìn)一步加強(qiáng)Cdx2和Eomes的轉(zhuǎn)錄[10]。Gata4、Gata6、Sox17以及Fgfr2和Fgfr4是外滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控原始外胚層的分化[11]。Tead4定位于原始外胚層中的線粒體，主要作用于原始外胚層中代謝的建立[12]。另外多分化因子Lif可以支持卵裂期細(xì)胞和囊胚發(fā)育，促進(jìn)胚胎著床[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IVC組的多能因子、滋養(yǎng)層細(xì)胞分化相關(guān)基因、原始外胚層分化調(diào)控基因等多個囊胚命運(yùn)決定因子的基因表達(dá)發(fā)生顯著改變；既往研究表明，對山羊和貓的胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，也出現(xiàn)了早期胚胎命運(yùn)決定因子的變化[14-15]。以上研究提示，單純體外培養(yǎng)環(huán)境即可影響囊胚的早期命運(yùn)。

DNA的精確復(fù)制和遺傳對維持基因組穩(wěn)定具有重要作用。如果早期胚胎在DNA復(fù)制和遺傳過程中發(fā)生損傷，可能影響胚胎及子代發(fā)育。既往有研究提示ART技術(shù)可導(dǎo)致DNA損傷[2，4，6]。與ART相關(guān)的DNA損傷是影響配子質(zhì)量和胚胎發(fā)育的重要因素[16]。體外培養(yǎng)技術(shù)是ART中重要的組成部分，故本研究進(jìn)一步對經(jīng)過體外培養(yǎng)的小鼠囊胚DNA損傷及相關(guān)損傷修復(fù)因子的表達(dá)進(jìn)行分析。

H2AX是哺乳動物細(xì)胞中核心組蛋白H2A的亞型，當(dāng)發(fā)生DSB時，H2AX蛋白發(fā)生磷酸化形成γH2AX。因此，對γH2AX的識別成為檢測DSBs的理想手段[3]。本研究中采用免疫熒光法對兩組胚胎中γ-H2AX的表達(dá)進(jìn)行分析從而間接顯示兩組胚胎DNA的損傷程度，結(jié)果顯示IVC組γH2AX相對熒光密度顯著升高。以上結(jié)果提示，體外培養(yǎng)可導(dǎo)致囊胚中DNA雙鏈斷裂損傷的發(fā)生風(fēng)險增加。在DSBs過程中，一些因子可在細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重排、DNA修復(fù)等過程中發(fā)揮作用。Gadd45a參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[17]。Fas系統(tǒng)是死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要凋亡途徑之一，Casp3是Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路中的核心蛋白，是細(xì)胞凋亡性死亡的最終執(zhí)行者[18]。Ddit3參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與的凋亡通路[19]。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，IVC組的DNA損傷相關(guān)基因Fas、Gadd45a和Ddit3的表達(dá)顯著上升。提示體外培養(yǎng)環(huán)境可在導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂損傷，并在多個方面發(fā)揮作用，可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和染色質(zhì)重排，最終影響囊胚的發(fā)育。

關(guān)于ART技術(shù)導(dǎo)致DNA損傷的研究發(fā)現(xiàn)，體外受精-胚胎移植的小鼠胎兒腦組織中DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)顯著改變[6]，玻璃化冷凍技術(shù)可以導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞DNA損傷加劇[4]。以上研究包括本項研究均提示ART技術(shù)與DNA損傷具有密切關(guān)系，關(guān)于其對后續(xù)胎鼠發(fā)育的影響仍需要進(jìn)一步研究。

綜上，本研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)可導(dǎo)致小鼠囊胚多能因子及早期胚胎命運(yùn)決定基因表達(dá)水平發(fā)生改變，影響小鼠囊胚發(fā)育潛能。這與IVC組小鼠囊胚DNA損傷增加、DNA損傷相關(guān)基因的表達(dá)異常具有潛在聯(lián)系。