王 丹，閆泉香，章朦玥，薛金艷，竇 恒，王 琳，張怡軒*

(1.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司，遼寧 本溪 117004；3.沈陽廣播電視大學(xué)，遼寧 沈陽 110003)

在全球范圍內(nèi)，每年約有50余萬例新發(fā)宮頸癌患者，約有20多萬女性死于宮頸癌。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)2018癌癥發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)報告顯示，在女性中，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均排名第四[1]，是危害女性生命健康的主要因素之一。隨著我國“兩癌”篩查的大力推廣及宮頸癌普治工作的開展，發(fā)現(xiàn)農(nóng)村經(jīng)濟落后地區(qū)是我國宮頸癌防治的重點，但是城市女性宮頸癌的防治形勢也不容樂觀[2]。因此為解決女性痛苦，尋求一種價格低、療效好的預(yù)防及治療藥物就顯得尤為迫切。紅色諾卡氏菌為好氧菌，革蘭染色陽性，屬于放線菌[3]的一種。紅色諾卡氏菌Nr-8206株主要的有效成分為組成其細(xì)胞壁的多糖、胞壁酸和黏肽等。遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司生產(chǎn)的外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架凍干粉制劑，以菌株Nr-8206作為生產(chǎn)菌株，經(jīng)發(fā)酵傳代獲得菌體，其菌體經(jīng)破碎、化學(xué)提取后進一步精制加工制得。外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，能夠提高免疫細(xì)胞CD4+T淋巴細(xì)胞[4]、CD8+T淋巴細(xì)胞[5]、巨噬細(xì)胞[6]及自然殺傷細(xì)胞[7]的活化作用和增殖促進作用，從而調(diào)節(jié)人體自身免疫系統(tǒng)，增強宮頸局部免疫功能，可有效清除HPV感染、治療宮頸癌前病變，預(yù)防宮頸癌[8]，臨床治療效果良好[9-10]。目前，菌株Nr-8206的不同培養(yǎng)形態(tài)對其生物量、有效物質(zhì)的含量及其雜質(zhì)殘留量的影響尚無相關(guān)研究。本研究擬通過篩選紅色諾卡氏菌株Nr-8206的不同菌株培養(yǎng)形態(tài)，結(jié)合不同形態(tài)生物量，研究不同形態(tài)與其有效物質(zhì)及雜質(zhì)之間的關(guān)系，篩選出最佳的培養(yǎng)形態(tài)。為企業(yè)提供高產(chǎn)菌株菌體及有效物質(zhì)產(chǎn)率，從而提升產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量，能夠給全國乃至全球女性帶來福音，具有廣泛的社會意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 紅色諾卡氏菌菌株Nr-8206(NocardiarubraNr-8206)，由遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①甘油瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉0.3 g，甘油10 mL，pH 7.2～7.5，溶于1 000 mL蒸餾水中；②肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉0.3 g，甘油10 mL，pH 7.2～7.5，溶于1 000 mL蒸餾水中。

1.1.3 試劑與儀器 阿拉伯糖對照品(WXBB6540V，SIGMA)；胞壁酸對照品(WXBB8072V，SIGMA)；血清白蛋白(牛)對照品(140619-201622，中國食品藥品檢定研究院)；牛肉膏、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。電子天平(JA203,上海?？惦娮觾x器廠)；自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40SBI，上海申安醫(yī)療器械廠)；雙人單面超凈工作臺(SW-CJ-ZD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9070A，上海森新試驗儀器有限公司)；全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZL-F160，江蘇太倉華大實驗儀器科技有限公司)；臺式離心機(TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)；光學(xué)顯微鏡(XSP-C204，重慶光電儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(UV-2600，島津儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)壯培養(yǎng)形態(tài)的分離篩選 甘油瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃，30 min滅菌處理后，制成甘油瓊脂培養(yǎng)基平板。在超凈工作臺中，取一支菌株Nr-8206凍干管，加入300 μL無菌蒸餾水復(fù)溶，制成菌懸液，分別涂布[11]于3個平行平板，33 ℃恒溫培養(yǎng)8 d；依據(jù)菌落直徑大小，將所有單菌落分為小菌落(直徑0～1.0 mm)、中菌落(直徑1.0～2.0 mm)、大菌落(直徑2.0 mm以上)三類，在每一類中選取一個典型形態(tài)單菌落，分別編號為RY1、RY2、RY3。分別挑取RY1、RY2、RY3單菌落劃線，將菌株Nr-8206菌落(出發(fā)菌株)無菌蒸餾水溶解挑一環(huán)劃線，分別傳代至甘油瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個菌落3個平行，33 ℃培養(yǎng)4 d后，用適量無菌蒸餾水懸浮菌體，5 000 r/min離心3 min，棄上清，稱重，分別配制成100 mg/mL菌懸液，每管加入200 μL該菌懸液制成一個甘油保藏管，-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.2 插片法美藍染色形態(tài)觀察 將分離出的單菌落分別接種于甘油瓊脂培養(yǎng)基上并插片，33 ℃恒溫倒置培養(yǎng)4 d后，美藍染色制片于XSP-C204型光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

1.2.3 菌株生理生化特征 針對菌株Nr-8206的特性，設(shè)計碳氮源利用試驗、MR試驗、V-P試驗、色氨酸分解試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗以及牛奶凝固與胨化、明膠液化、纖維素分解、淀粉水解、硝酸鹽還原、脲酶、淀粉酶和酯酶等生理生化試驗[12]，采用Shirling等[13]方法進行實驗并觀察記錄。

1.2.4 菌體生物量分析 將配制的甘油瓊脂培養(yǎng)基分裝于試管中，121 ℃滅菌30 min后制成試管斜面?zhèn)溆?。以菌株Nr-8206(出發(fā)菌株)作為對照，分別將對照菌株及不同形態(tài)菌株在甘油瓊脂培養(yǎng)基平板劃線傳代，分別挑取大小相同的單菌落接種于試管斜面上，每個菌落接種3個試管斜面，33 ℃培養(yǎng)4 d后，10 mL無菌水清洗菌體，分別轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)基，每個三角瓶150 mL)中，150 r/min，33 ℃培養(yǎng)4 d，3 000 r/min離心15 min。收集菌體，測定濕菌體含量(g/mL)。

1.2.5 有效物質(zhì)及雜質(zhì)測定 ①原液的獲得：取分離篩選時保藏的菌株Nr-8206(出發(fā)菌株)、RY1、RY2、RY3甘油管各一支，分別接種于1個試管斜面(甘油瓊脂培養(yǎng)基)，33 ℃培養(yǎng)4 d，每個試管斜面對應(yīng)轉(zhuǎn)入1個克氏瓶內(nèi)(甘油瓊脂培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，再分別轉(zhuǎn)入三角瓶內(nèi)(肉湯培養(yǎng)基)培養(yǎng)4 d增菌，棄去上清液，加無菌蒸餾水約100 mL，制備成菌懸液。吸取菌懸液加入克氏瓶內(nèi)(每瓶加入5 mL)，RY1、RY2、RY3各接種20個克氏瓶，33 ℃培養(yǎng)5 d，在超凈臺下，克氏瓶內(nèi)加少許無菌蒸餾水，刮洗收集菌苔，其菌懸液于3 060 r/min離心10 min，棄上清液，稱濕菌體質(zhì)量，按濕菌體與無菌蒸餾水的質(zhì)量比1∶4配制成菌懸液，超聲波破碎至顯微觀察無活菌，獲得產(chǎn)物加入鏈蛋白酶溶液(0.53 mg/mL)和胰蛋白酶溶液(8 mg/mL)聯(lián)合作用12 h，16 000 r/min離心30 min，反復(fù)清洗離心3次，除去蛋白質(zhì),除雜后稱干質(zhì)量，加無菌蒸餾水將原液配制成50 mg/mL的溶液。②原液多糖含量測定[14]：分別配制20、40、50、60、80、100 μg/mL阿拉伯糖對照品工作液，純化水作空白對照，在水浴冷卻條件下，分別加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蒽酮乙酸乙酯溶液0.25 mL、濃硫酸2.0 mL，搖勻，80 ℃水浴30 min，水冷卻至室溫，625 nm波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，阿拉伯糖濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.005 03x-0.026 84，r2=0.992 7。取原液10 μL，加純化水稀釋至1.0 mL置于一具塞試管中，與對照品工作液同法處理，625 nm波長處測定菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3原液濃度，每個樣品測定3份，通過計算獲得糖含量。計算公式：原液糖含量(mg/mL)=原液濃度×原液稀釋倍數(shù)/1 000。③原液胞壁酸含量測定：分別配制0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL胞壁酸對照品工作液，純化水作空白對照，分別加入4%硫酸銅溶液100 μL，振蕩20 s，加入6 mL濃硫酸，振蕩20 s混勻，100 ℃水浴10 min，水冷卻至室溫，加入100 μL 1.5%對羥基聯(lián)苯溶液，立即振蕩20 s混勻。25 ℃水浴呈色30 min后，100 ℃水浴90 s使溶液澄清。564 nm波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，以胞壁酸濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.015 38x-0.001 35，r2=0.999 3。取原液20 μL，加水使其最終體積為1.0 mL至一具塞試管中，與對照品工作液同樣處理，564 nm波長處測定菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3原液濃度，每個樣品測定3份，計算獲得胞壁酸含量，計算公式：胞壁酸含量(μg/mL)=原液濃度×原液稀釋倍數(shù)。④原液蛋白質(zhì)殘余量測定：分別配制20、40、60、80、100 μg/mL血清白蛋白(牛)對照品工作液，純化水作空白對照，分別加堿性銅試液1.0 mL，搖勻，室溫放置10 min，快速加入福林酚試液4.0 mL，搖勻，室溫放置30 min。650 nm波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，以血清白蛋白(牛)濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.000 15x-0.002 83，r2=0.997 0。取原液50 μL(稀釋倍數(shù)為20倍)置試管內(nèi)，加水至1 mL，與對照品工作液同樣處理，650 nm波長處測定菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3原液濃度，每個樣品測定3份，計算蛋白質(zhì)含量，計算公式：

式中：原液濃度單位為μg/mL；原液稀釋倍數(shù)為20倍；原液固體總量(g/mL)=烘干后樣品質(zhì)量/樣品體積×100%(105 ℃烘干至恒質(zhì)量)；兩個103(即106)為原液濃度(μg/mL)與固體總量的單位換算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株復(fù)壯培養(yǎng)形態(tài)的分離篩選

通過對菌株Nr-8206進行復(fù)壯培養(yǎng)(圖1)和形態(tài)統(tǒng)計，小菌落(直徑0～1.0 mm)占比3.63%，中菌落(直徑1.0～2.0 mm)占比58.10%，大菌落(直徑2.0 mm以上)占比38.27%。小、中、大菌落中各選出1個，共選出3個典型形態(tài)(圖2)，分別編號為RY1(圖2A)、RY2(圖2B)、RY3(圖2C)。RY1菌落直徑0.60 mm，淡黃色，突起不明顯，無褶皺，圓形；RY2菌落直徑1.68 mm，橘色，有突起，有褶皺，菌落邊緣呈絲狀；RY3菌落直徑2.56 mm，橘紅色，有突起，有褶皺，菌落邊緣呈放射狀。

圖1 紅色諾卡氏菌Nr-8206株在3個平行甘油瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d的形態(tài)

圖2 紅色諾卡氏菌Nr-8206株在甘油瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d挑選出的單菌落形態(tài)

2.2 菌體形態(tài)

將RY1、RY2、RY3分別接種于甘油瓊脂培養(yǎng)基上并插片，33 ℃培養(yǎng)4 d后，美藍染色光學(xué)顯微鏡下放大1 000倍觀察其結(jié)構(gòu)特征(圖3)，RY1(圖3A)菌體球狀或短桿狀有橫膈膜，RY2(圖3B)菌體呈球狀或短桿狀有橫隔膜，RY3(圖3C)菌體見分支狀，可見明顯橫膈膜，菌體大部分為長鏈(或桿)狀。三種形態(tài)的菌體在顯微鏡下觀察，橫徑無明顯差別，說明遺傳穩(wěn)定性高。RY1(圖3A)、RY2(圖3B)結(jié)構(gòu)無明顯差別，RY3(圖3C)菌體見分支狀且多長鏈(或桿)，說明三種形態(tài)可能處于不同的生長期。

圖3 RY1、RY2、RY3三種形態(tài)的菌株培養(yǎng)4 d的光學(xué)顯微鏡形態(tài)

2.3 菌株生理生化特征

通過對RY1、RY2、RY3生理生化特征分析，發(fā)現(xiàn)三種形態(tài)的菌株生理生化特征完全一致，無差別，均表現(xiàn)為具有過氧化氫酶，能催化過氧化氫分解；產(chǎn)生脂酶能夠分解Tween-20、40、60形成暈圈，但不能分解Tween-80；硝酸鹽還原結(jié)果陽性，能夠還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；不產(chǎn)生氧化酶、脲酶、淀粉酶和纖維素酶；不產(chǎn)生硫化氫，不能使脫脂牛奶產(chǎn)生凝固與胨化現(xiàn)象，不能使明膠產(chǎn)生液化現(xiàn)象，不能分解色氨酸，MR、V-P試驗均為陰性。能夠利用葡萄糖、果糖、巖藻糖、D-甘露糖生長代謝，對L-鼠李糖、D-半乳糖、D-木糖呈現(xiàn)出弱利用特征，不利用棉子糖、阿拉伯糖、麥芽糖。能夠利用纈氨酸，弱利用賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、丙氨酸和脯氨酸4種氮源，不利用甲硫氨酸和谷氨酸(表1)。

表1 RY1、RY2、RY3的生理生化特征

2.4 菌體生物量分析

培養(yǎng)及收集出發(fā)菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3濕菌體，測定濕菌體生物量分別為0.152 1、0.129 5、0.169 1、0.158 5 g/mL，RY2濕菌體含量最高，較Nr-8206(出發(fā)菌株)提高了11%，其次為RY3，其濕菌體含量與Nr-8206相差不多，RY1濕菌體生物量最低，降低15%(圖4A)。

2.5 有效物質(zhì)及雜質(zhì)測定

紫外分光光度法測得出發(fā)菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3的細(xì)胞壁多糖含量分別為4.5、3.4、5.2、2.2 mg/mL(圖4B)；進一步測定，測得菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3的胞壁酸含量分別為384、284、438、231 μg/mL(圖4C)；Nr-8206、RY1、RY2、RY3的蛋白質(zhì)殘余量為8.8%、13.4%、6.9%、9.6%(圖4D)。對比分析可見，RY2的糖含量最高，是Nr-8206的1.12倍，胞壁酸含量也最高，是Nr-8206的1.14倍，蛋白質(zhì)殘余量最低，較Nr-8206降低了22%。RY1糖含量、胞壁酸含量高于RY3，但低于RY2和Nr-8206，并且蛋白質(zhì)殘余量最高，雜質(zhì)不易去除。RY3糖含量、胞壁酸含量最低，蛋白質(zhì)殘余量也高于Nr-8206，雜質(zhì)也相對不容易去除。

將菌株Nr-8206、RY1、RY2及RY3生物量對比(圖4A)，RY2生物量最高，且有效物質(zhì)糖含量、胞壁酸含量最高，蛋白質(zhì)殘余量最低，雜質(zhì)更容易去除，綜合表現(xiàn)最優(yōu)。

圖4 紅色諾卡氏菌Nr-8206株、RY1、RY2、RY3生物量、糖含量、胞壁酸含量和蛋白質(zhì)殘余量的對比結(jié)果

3 討 論

本研究通過復(fù)壯紅色諾卡氏菌Nr-8206株，經(jīng)涂布后進行形態(tài)學(xué)統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)大、中、小三種菌落形態(tài)，每種形態(tài)各選一個典型形態(tài)進行研究分析。經(jīng)對三種形態(tài)菌株進行生物量分析、有效物質(zhì)糖含量、胞壁酸含量及雜質(zhì)蛋白質(zhì)的殘余量的測定，對比分析結(jié)果顯示，RY2為最佳培養(yǎng)形態(tài)，其菌落直徑1.68 mm，橘色，有突起，有褶皺，菌落邊緣呈絲狀，光學(xué)顯微觀察菌體呈球狀或短桿狀有橫隔膜。RY2發(fā)酵生物量明顯高于出發(fā)菌株Nr-8206，較其提高11%，且均高于RY1和RY3。RY2有效物質(zhì)糖含量為出發(fā)菌株Nr-8206的1.12倍，胞壁酸含量為出發(fā)菌株Nr-8206的1.14倍，且均遠(yuǎn)高于RY1和RY3。RY2雜質(zhì)蛋白質(zhì)的殘余量較出發(fā)菌株Nr-8206降低22%，其雜質(zhì)也更容易去除，綜合表現(xiàn)較好。

篩選高性能、高質(zhì)量的菌株，以達到提高目標(biāo)有效成分產(chǎn)量和產(chǎn)率的目的[15]，為生產(chǎn)高附加值生物制劑提供充足的原料。菌株的優(yōu)選依賴于合理的篩選途徑，可靠的試驗方法，本研究通過復(fù)壯、涂布、形態(tài)學(xué)觀察及統(tǒng)計分析等經(jīng)典菌株篩選方法，挑選出具有典型特征的菌落形態(tài)，同時結(jié)合生物量并對菌株Nr-8206的有效物質(zhì)和雜質(zhì)質(zhì)量指標(biāo)，通過紫外可見光分光光度法測定分析，進一步確定優(yōu)勢菌落形態(tài)，為今后挑取Nr-8206活性良好的菌株提供標(biāo)準(zhǔn)。通過本研究結(jié)果可知，優(yōu)勢菌株RY2屬于中菌落形態(tài)，而中菌落形態(tài)占出發(fā)菌株復(fù)壯總菌落數(shù)量的58.10%，說明中菌落形態(tài)具有較強活性，選擇中菌落形態(tài)能最大限度的發(fā)揮其穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)的作用[16]。本研究同時對菌株Nr-8206的三種形態(tài)分別進行了生理生化特征分析，三種形態(tài)生理生化特征無差別。這些生理生化特性對文獻參閱、種屬特性判斷以及對該菌株生理生化研究信息的補充具有重要意義。同時，本研究對于今后發(fā)酵技術(shù)的改進和分離純化都有重要的參考作用[17]。