陳文迪，張?jiān)婄?，王亞楠，李詠賢，劉 穎，徐宏偉*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 臨床檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)，山東 青島 266071；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

抑郁癥是一種常見的精神障礙性疾病，我國(guó)的發(fā)病率約為4%[1]。該病患者具有極強(qiáng)的自殺傾向，給個(gè)人、家庭及社會(huì)均帶來(lái)巨大壓力和沉重負(fù)擔(dān)[2]。因此，對(duì)抑郁癥的深入研究成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一[3]。被動(dòng)游泳可誘發(fā)小鼠抑郁樣行為[4]，與酒精戒斷、慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激(CUMS)等誘導(dǎo)抑郁樣行為的建模原理及方式不同，該模型屬于“行為絕望”抑郁模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的損傷更為溫和，與人類慢性、低水平應(yīng)激源導(dǎo)致抑郁癥的機(jī)理更為接近，因此成為抑郁癥發(fā)病機(jī)理及藥物防治理想的研究工具和實(shí)驗(yàn)手段[5-6]。研究顯示，對(duì)于被動(dòng)游泳小鼠，水溫及持續(xù)時(shí)間等環(huán)境因素的改變對(duì)其抑郁樣行為的形成產(chǎn)生重要影響[7]；水質(zhì)的不同也成為相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)影響因素之一[8]。近年來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人群研究均表明，“腸道微生物群-大腦軸”已作為一種潛在的腦功能失調(diào)病理生理機(jī)制參與自閉癥、抑郁癥、焦慮癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。因此，本研究擬通過在不同條件下的被進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)獲得抑郁樣小鼠模型；同時(shí)，采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)對(duì)小鼠腸道菌群進(jìn)行系統(tǒng)的分子生態(tài)學(xué)分析，觀察抑郁樣行為小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成的特征性改變，并進(jìn)一步探討抑郁樣行為嚴(yán)重程度與腸道菌群組成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡雄性C57BL/6J小鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(SCXK(京)2016-0006)，體質(zhì)量約20 g，遺傳背景明確。小鼠飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SYXK(魯)2015-0003)，各組小鼠自由進(jìn)食和飲水，鼠房環(huán)境保持溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h光照/黑暗交替。本研究獲得青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2018 審字第 02)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 蔗糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(分析純)；脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis，ATCC 25285)及嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，ATCC 11073)標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，4 ℃保存。糞便基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自QIAgen；Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0購(gòu)自TaKaRa；淡水取自新鮮自來(lái)水；海水取自青島沿岸近海海域，經(jīng)4層濾紙過濾去除水中漂浮物。將自來(lái)水及經(jīng)過濾處理的海水行0.22 μm濾膜過濾，作為小鼠游泳實(shí)驗(yàn)用水。玻璃泳槽(70 cm×50 cm×50 cm)；紫外微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，美國(guó)Thermo)；PCR擴(kuò)增儀(T100，美國(guó)Bio-Rad)；電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Realplex4，德國(guó)Eppendorf)。16S rDNA高通量測(cè)序分析委托上海銳翌生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 35只6周齡雄性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組(n=5)，包括正常對(duì)照組(A組)、室溫(22±2)℃淡水15 min組(B組)、室溫淡水5 min組(C組)、室溫海水15 min組(D組)、室溫海水5 min組(E組)、低溫(8±2)℃淡水5 min組(F組)及低溫海水5 min組(G組)。每日18：00時(shí)按以下方法對(duì)小鼠實(shí)施游泳運(yùn)動(dòng)：A組不游泳；B組于室溫淡水中游泳15 min；C組于室溫淡水中游泳5 min；D組于室溫海水中游泳15 min；E組于室溫海水中游泳5 min；F組于低溫淡水中游泳5 min；G組于低溫海水中游泳5 min。實(shí)驗(yàn)期間，用玻璃棒驅(qū)趕小鼠在玻璃泳槽中不停歇地游泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撈出小鼠并將其拭干(海水游泳小鼠采用淡水噴淋后拭干)，放回飼養(yǎng)籠中。每周更換新鮮自來(lái)水及海水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)16周，每周記錄小鼠體質(zhì)量變化。于16周末留取小鼠糞便，-80 ℃凍存，用于腸道菌群分子生態(tài)學(xué)檢測(cè)；同時(shí)對(duì)各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1.2.2 糖水偏愛實(shí)驗(yàn) 于實(shí)驗(yàn)第0周和第16周末分別進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。本研究參照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的糖水偏愛實(shí)驗(yàn)方法并做了部分改進(jìn)。為了消除小鼠對(duì)蔗糖溶液的恐懼，在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，為每只小鼠提供2瓶0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液，持續(xù)飲用24 h。隨后，隨機(jī)將其中一瓶蔗糖溶液替換為自來(lái)水，繼續(xù)飲用24 h。禁食禁水24 h后，進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)，即向每只小鼠分別提供1瓶0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液和1瓶自來(lái)水自由飲用12 h，并分別記錄其初始瓶質(zhì)量及第12小時(shí)末瓶質(zhì)量。期間，于飲用第0.5小時(shí)和第6小時(shí)交換一次水瓶位置，以消除小鼠因位置偏好對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

小鼠糖水偏愛度(%)=

1.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 于實(shí)驗(yàn)第16周末進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。早7：00時(shí)將小鼠引入行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，以適應(yīng)其安靜且視野較暗的環(huán)境，2 h后開始強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，并在3 h內(nèi)完成。將小鼠置于25 cm(高)×10 cm(直徑)的圓柱形泳槽中，水深10 cm，水溫(22±2)℃。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6 min，記錄最后4 min“不動(dòng)”時(shí)間，即小鼠停止掙扎，僅靠四肢的輕微運(yùn)動(dòng)保持頭部漂浮在水面以上的時(shí)間。本研究采用 SMART v3.0 軟件，將小鼠“不動(dòng)”的判定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為運(yùn)動(dòng)速度小于 0.6 cm2/s，每隔 0.5 s記錄一次。每次實(shí)驗(yàn)前，更換新鮮自來(lái)水，消除其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撈出小鼠并將其拭干，放回飼養(yǎng)籠中。

1.2.4 糞便腸道菌群16S rDNA 高通量測(cè)序 稱取小鼠糞便樣品200 mg，采用糞便基因組DNA提取試劑盒獲得腸道菌群基因組DNA，通過NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)和1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行濃度及純度質(zhì)量檢測(cè)。以質(zhì)檢合格的基因組DNA為模板，使用通用引物341F(5′-CCTACGGGRSGCAG CAG-3′)和806R(5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)，對(duì)其16S rDNA V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得425 bp左右擴(kuò)增片段。采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切膠回收，并進(jìn)行質(zhì)檢和定量。隨后，通過Illumina Hiseq PE250平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行多重測(cè)序，獲得250×2 bp雙端序列。采用PANDAseq軟件組裝原始序列，并按照以下質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾：原始序列長(zhǎng)度在220～500 bp之間；最小平均質(zhì)量值為20(Q20)，最大含N堿基數(shù)為3。使用Usearch軟件將上述優(yōu)化序列中具有97%以上相似度的核苷酸序列進(jìn)行聚類和嵌合體過濾，得到用于物種分類的操作分類單元(OTUs)。所有樣本隨機(jī)抽樣至均勻深度后，提取各OTUs代表序列，通過RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而在門、綱、目、科、屬水平對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種歸類和豐度分析，最小置信閾值為0.8；采用QIIME軟件進(jìn)行PCoA菌群多樣性分析；采用LEfSe方法篩選具有顯著差異(LDA>2)的關(guān)鍵物種。

1.2.5 糞便中擬桿菌及乳桿菌定量分析 ①引物設(shè)計(jì)與合成：參照Bernhard 等[12]報(bào)道的方法及脆弱擬桿菌和嗜酸乳桿菌 16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)擬桿菌屬及乳桿菌屬特異性16S rDNA 片段PCR引物，并通過NCBI BLAST 基因庫(kù)對(duì)引物序列特異性進(jìn)行比對(duì)評(píng)價(jià)。各菌屬16S rDNA PCR擴(kuò)增片段特異性引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度及退火溫度見表1。引物合成委托上海生工生物工程有限公司完成。②標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA提?。悍謩e準(zhǔn)確稱取脆弱擬桿菌及嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，嚴(yán)格按照說明書操作，-20 ℃保存。③標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以上述脆弱擬桿菌及嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，獲得16S rDNA PCR片段擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，最佳退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。以PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80 V，電泳40 min)。將目的條帶切膠、回收、純化后，以紫外微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，并換算為各標(biāo)準(zhǔn)品1 μL拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。將純化的脆弱擬桿菌及嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)品16S rDNA PCR片段擴(kuò)增產(chǎn)物做10倍系列稀釋，使成為l×109～1×102拷貝/μL。以此為模板，在SYBR Green熒光染料的作用下，對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，最佳退火溫度20 s，72 ℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件Eppendorf Mastercycler ep realplex自動(dòng)分析各標(biāo)準(zhǔn)品初始循環(huán)數(shù)(Ct值)，以此作為縱坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)品初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。④大鼠腸道菌群中擬桿菌屬及乳桿菌屬定量檢測(cè)：調(diào)整上述各組大鼠腸道菌群基因組DNA濃度為50～80 ng/μL，以此為模板，進(jìn)行擬桿菌屬及乳桿菌屬16S rDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)品及ddH2O代替DNA模板作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，每個(gè)樣品均設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔。獲得Ct值后，通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品擬桿菌屬及乳桿菌屬拷貝數(shù)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。

表1 各菌屬16S rDNA PCR擴(kuò)增片段特異性引物序列及退火溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示，第1周至第8周，各組小鼠體質(zhì)量均呈不同程度上升趨勢(shì)；第8周開始至第16周，各模型組體質(zhì)量均較正常對(duì)照組逐漸下降。D組小鼠的體質(zhì)量下降最為明顯，第16周末達(dá)到(20.5±1.6)g，較正常對(duì)照組(23.9±2.3)g下降了14.2百分點(diǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠行為學(xué)的影響

2.2.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)之前，各組小鼠糖水偏愛度沒有顯著性差異(P>0.05)。游泳運(yùn)動(dòng)16周后，各模型組小鼠糖水偏愛度普遍降低，與正常對(duì)照組(A組，(80.4±8.3)%)比較，分別下降了6.3百分點(diǎn)(B組)、9.3百分點(diǎn)(C組)、20.1百分點(diǎn)(D組)、12.4百分點(diǎn)(E組)、9.4百分點(diǎn)(F組)及11.7百分點(diǎn)(G組)。其中D、F、G組糖水偏愛度與正常對(duì)照組比較，均具有顯著性差異，尤其是D組小鼠糖水偏愛度降低幅度最大，且較F組具有顯著性差異(P<0.05)，見圖2。

2.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，模型組小鼠不動(dòng)時(shí)間分別較正常對(duì)照組(117.2±35.3)s延長(zhǎng)了8.7百分點(diǎn)(B組)、14.6百分點(diǎn)(C組)、50.5百分點(diǎn)(D組)、24.7百分點(diǎn)(E組)、21.8百分點(diǎn)(F組)及27.4百分點(diǎn)(G組)。其中，D、E、F、G組不動(dòng)時(shí)間與正常對(duì)照組比較具有顯著性差異，且D組小鼠在各模型組中不動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)(P<0.05)，見圖3。

2.3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腸道菌群分子生態(tài)學(xué)的影響

2.3.1 糞便腸道菌群16S rDNA 高通量測(cè)序 ①Alpha多樣性：采用Alpha多樣性指數(shù)對(duì)小鼠腸道菌群測(cè)序深度、豐度和均勻度進(jìn)行評(píng)估。物種累計(jì)曲線及goods coverage指數(shù)用于反映菌群測(cè)序深度，Chao 指數(shù)用于反映菌群豐度；Shannon指數(shù)則用于反映菌群均勻度。結(jié)果顯示，物種累計(jì)曲線趨于平穩(wěn)，同時(shí)各組樣品goods coverage均超過99%，提示樣品中絕大部分物種均被檢測(cè)到，可用于后續(xù)分析。同時(shí)，各組間Chao指數(shù)及Shannon指數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)，提示游泳運(yùn)動(dòng)使小鼠腸道菌群豐度及均勻度發(fā)生改變。見圖4Ⅰ～Ⅳ。②Beta多樣性：使用主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)展示各組樣品間結(jié)構(gòu)和組成方面的多樣性差異。兩個(gè)樣品距離越近，則表示這兩個(gè)樣品的物種組成越相近，差異越小。結(jié)果顯示，模型組小鼠與正常對(duì)照組之間物種多樣性存在顯著差異(P=0.014)，同時(shí)Anosim相似性分析結(jié)果也顯示，各組間菌群組成明顯不同(R=0.332，P=0.001)，提示游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腸道菌群多樣性產(chǎn)生顯著影響。見圖4Ⅴ～Ⅵ。③物種組成分析：結(jié)果顯示，各模型組小鼠腸道菌群從門水平到屬水平的多個(gè)物種豐度較正常對(duì)照組具有顯著差異。其中，室溫海水游泳15 min小鼠(D組)腸道菌群的變化最為明顯。如：與正常對(duì)照組比較，D組小鼠腸道菌群中擬桿菌在門(Bacteroidetes)、綱(Bacteroidia)、目(Bacteroidales)、科(Bacteroidaceae)、屬(Bacteroides)水平的豐度分別增加了68.3百分點(diǎn)、67.5百分點(diǎn)、67.4百分點(diǎn)、34.9倍和14.2倍(P<0.05)。此外，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及普雷沃氏菌屬(Prevotella)豐度分別較正常對(duì)照組增加了4.5倍和6.1倍。而D組厚壁菌門(Firmicutes)、梭狀芽胞桿菌綱(Clostridia)、梭狀芽胞桿菌目(Clostridiales)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)及乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度則較正常對(duì)照組分別顯著減少了50.5百分點(diǎn)、53.9百分點(diǎn)、54.0百分點(diǎn)、39.4百分點(diǎn)和61.8百分點(diǎn)(P<0.05)，見圖5Ⅰ～Ⅴ。LDA EffectSize(LEfSe)分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，模型組小鼠在門、綱、目、科、屬水平有多個(gè)物種豐度與正常對(duì)照組存在顯著差異(LDA>2)，提示游泳運(yùn)動(dòng)使小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生特征性改變。其中，室溫海水游泳15 min小鼠(D組)具有顯著差異的物種最多，從門水平到屬水平共有1個(gè)菌門、4個(gè)菌綱、4個(gè)菌目、7個(gè)菌科及10個(gè)菌屬在該組富集。見圖6。

圖4 各組小鼠腸道菌群Alpha及 Beta多樣性分析

圖5 各組小鼠腸道菌群物種組成分析

圖6 各組小鼠腸道菌群LEfSe分析圖

2.3.2 糞便中擬桿菌及乳桿菌實(shí)時(shí)熒光定量分析 根據(jù)擬桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Ct值及初始拷貝數(shù)獲得擬桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-4.007x+44.63(R2=0.998)；乳桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.112x+40.21(R2=0.988)。與正常對(duì)照組比較，模型組糞便中擬桿菌含量呈不同程度升高，而乳桿菌含量均較正常對(duì)照組減少。其中，D組擬桿菌及乳桿菌含量均較正常對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.01),見圖7。

圖7 各組小鼠腸道中擬桿菌屬及乳桿菌屬定量分析

3 討 論

糖水偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抑郁樣行為最常用的方法之一[13-14]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)C57BL/6J小鼠實(shí)施被動(dòng)游泳運(yùn)動(dòng)之前，各組小鼠體質(zhì)量及糖水偏愛度均無(wú)明顯差別。但被動(dòng)游泳16周后，各模型組小鼠體質(zhì)量及糖水偏愛度均較正常對(duì)照組小鼠有不同程度降低，且強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間均較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，表明已成功建立小鼠抑郁樣行為模型[11，15]。

本研究通過不同水質(zhì)、不同溫度及不同游泳時(shí)間，觀察被動(dòng)游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠抑郁樣行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用室溫海水進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)15 min的小鼠，其體質(zhì)量及糖水偏愛度下降均最為明顯，不動(dòng)時(shí)間也最長(zhǎng)，提示上述環(huán)境條件可能更易誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。這可能與海水含鹽量較高(約為30‰，為淡水含鹽量的10倍)，小鼠意外嗆入海水后受到的不良刺激較淡水更大有關(guān)；同時(shí)，小鼠互相撕咬造成皮膚破口，海水浸泡也可加重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不適感及氧化應(yīng)激損傷[16]。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行被動(dòng)游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，越易誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。更加值得關(guān)注的是，室溫游泳較低溫游泳更易誘發(fā)小鼠抑郁樣行為。其原因可能與適當(dāng)?shù)暮浯碳ねㄟ^對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，提高了機(jī)體的興奮性及適應(yīng)能力有關(guān)；同時(shí)，寒冷刺激促使機(jī)體，尤其是腦組織血液循環(huán)量增大、紅細(xì)胞攜氧量提高[17]，也在一定程度上緩解了小鼠抑郁情緒的產(chǎn)生。

研究顯示，被動(dòng)運(yùn)動(dòng)可引發(fā)腸道菌群的改變[18]，同時(shí)，近年來(lái)的大量研究也表明，腸道菌群與抑郁障礙密切相關(guān)[19]。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)被動(dòng)游泳小鼠糞便中腸道菌群進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，以觀察具有抑郁樣行為的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的特征性變化。

研究顯示，重度抑郁癥患者腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)比例明顯降低，而擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)豐度則顯著升高，其所屬50多個(gè)物種的豐度均較對(duì)照組有顯著差異[20]。Aizawa等[21]對(duì)43例重度抑郁患者糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)后也發(fā)現(xiàn)，重度抑郁患者較健康人更易出現(xiàn)雙歧桿菌及乳桿菌等有益菌含量計(jì)數(shù)較低的個(gè)體。抑郁障礙動(dòng)物模型中也同樣發(fā)現(xiàn)了腸道菌群紊亂現(xiàn)象。Jiang等[22]采用酒精戒斷的方式成功建立抑郁樣小鼠模型，在對(duì)其腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，具有抑郁樣行為的小鼠腸道中普氏菌屬(Prevotella)及擬桿菌屬(Bacterdies)等多個(gè)菌屬豐度與對(duì)照組相比均明顯不同。該研究進(jìn)一步通過糞菌移植實(shí)驗(yàn)將抑郁障礙小鼠腸道菌群移植給受體小鼠，發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出與供體小鼠一致的抑郁樣行為。Huang等[23]的研究則顯示，放線菌門(Actinobacteria)擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)豐度的改變可能是抑郁障礙及抗抑郁效果評(píng)價(jià)潛在的生物標(biāo)志物。本研究16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腸道菌群的豐度和多樣性與正常對(duì)照組小鼠相比均發(fā)生了明顯變化，從菌門到菌屬水平也存在多個(gè)物種豐度的顯著改變。值得關(guān)注的是，室溫海水游泳15 min的小鼠擬桿菌門(Bacteroidetes)及其所屬的擬桿菌屬(Bacteroides)豐度明顯增加，而厚壁菌門(Firmicutes)及其所屬的乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度則普遍下降，同時(shí)，該組小鼠存在普氏菌屬(Prevotella)等多個(gè)條件致病菌在該組富集的現(xiàn)象；針對(duì)擬桿菌屬及乳桿菌屬所做的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)也得到了與16S rDNA高通量測(cè)序較為一致的結(jié)果。研究認(rèn)為，擬桿菌的過度增殖與神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂和抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10，24]。Liu 等[25]通過對(duì)100名受試者糞便腸道菌群高通量測(cè)序分析也發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腸道菌群中存在大量擬桿菌及普氏菌。而乳桿菌作為一種益生菌，在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[26]及抑郁癥防治等方面也起到良好的改善效果。Slykerman等[27]募集423名14～16周的妊娠婦女，采用鼠李糖乳桿菌進(jìn)行孕期和產(chǎn)后干預(yù)，發(fā)現(xiàn)接受乳桿菌補(bǔ)充的產(chǎn)婦，其產(chǎn)后抑郁和焦慮得分明顯較低。以上這些研究均表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的變化，尤其是某些菌屬豐度的改變可能參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮關(guān)鍵作用。其作用機(jī)制可能是腸道菌群更易受到外界環(huán)境應(yīng)激源的影響，導(dǎo)致菌群紊亂。腸道中有害菌的過度增殖及益生菌的缺失，使得腸道內(nèi)有害物質(zhì)增多，從而影響腸道內(nèi)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫及代謝系統(tǒng)，進(jìn)一步對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[28-29]，引發(fā)抑郁情緒。也有學(xué)者認(rèn)為，對(duì)腦組織中環(huán)狀RNA-HIPK2表達(dá)的抑制作用及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙的調(diào)節(jié)作用，可能是腸道菌群參與機(jī)體抑郁樣行為的另一重要途徑和作用方式[30]。但它們究竟如何實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦生理、行為、情緒和認(rèn)知的影響，其作用機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，具有抑郁樣行為的小鼠，其腸道菌群組成發(fā)生特征性改變，并隨抑郁樣行為的嚴(yán)重程度有所變化，這為今后以腸道菌群為靶點(diǎn)進(jìn)行抑郁癥防治研究提供參考。