鄧雁文, 崔曉靜, 劉佳鑫, 黃鎮(zhèn)武, 孫恩浩, 方澤森, 王少丹, 周 遠(yuǎn), 呂曉彤, 阮 杰，, 王俊芳, 崔紅晶，*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 東莞 523808; 2.廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衰老研究所,廣東 東莞 523808;3.廣東醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 廣東 東莞 523808;4.廣東醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 東莞 523808)

釀酒酵母細(xì)胞處于生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生或外環(huán)境挑戰(zhàn)細(xì)胞壁完整性的時(shí)候，細(xì)胞壁以高度調(diào)控和極化的方式被重塑，這一過(guò)程主要被細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路(Cell wall integrity，CWI)所調(diào)控[1]。細(xì)胞表面感應(yīng)因子(如Wsc1-3p、Mid2p 和Mtl1p等)感受到應(yīng)激信號(hào)后，通過(guò)傳導(dǎo)給小G蛋白(Rho1p)進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶(The mitogen-activated protein kinase，MAPK)/Slt2p信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)CWI靶基因轉(zhuǎn)錄，改善細(xì)胞壁完整性[1]。在調(diào)控細(xì)胞壁重構(gòu)的過(guò)程中，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子Mpt5p和Ssd1p，以不依賴MAPK/Slt2p方式參與調(diào)控細(xì)胞壁的生物合成，或者通過(guò)間接機(jī)制調(diào)控細(xì)胞壁重構(gòu)[2-3]，以適應(yīng)細(xì)胞在生理或環(huán)境改變時(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。釀酒酵母蛋白質(zhì)O-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(ProteinO-mannosyltransferase，PMT)家族糖基化修飾膜蛋白質(zhì)和分泌蛋白質(zhì)，參與調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能[4]。PMT家族成員中Pmt1p(PMT1基因編碼)與Pmt2p(PMT2基因編碼)以異聚體的形式存于酵母細(xì)胞內(nèi)，在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡方面，以及細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育等方面起到重要作用[4]。廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室衰老研究所前期研究結(jié)果表明，與Pmt1p-Pmt2p異聚體相結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子Ted1p(Traffcking of Emp24p/Erv25p-dependent cargo disrupted)也參與調(diào)控細(xì)胞壽命和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，且進(jìn)一步缺失Pmt1p校正Ted1p的細(xì)胞壽命和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)方面的表型特征[5-6]。但有關(guān)Pmt1p和Ted1p在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的作用研究較少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究主要通過(guò)檢測(cè)酵母細(xì)胞分裂增殖活性，及細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路中相關(guān)效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，研究缺失PMT1和(或)TED1基因在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的抗性和細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路的活性，探討細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)能力與細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路活性之間的可能調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 單倍體釀酒酵母菌株BY4742(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0)由美國(guó)華盛頓大學(xué)Matt Kaeberlein博士贈(zèng)送，單基因缺失酵母菌株(pmt1Δ和ted1Δ)和雙基因缺失酵母菌株(pmt1Δted1Δ)為廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所構(gòu)建[6]。

1.1.2 試劑與儀器 酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自廣州威佳科技有限公司；剛果紅和熒光增白劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，按照說(shuō)明書(shū)分別配制成100 μg/mL和10 μg/mL的工作液；酵母RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler96，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI公司)；全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Bioscreen C，芬蘭Bioscreen公司)；多功能酶標(biāo)儀(Synergy z BioTek，美國(guó)伯騰儀器Bio-Tek有限公司)。

1.1.3 引物 引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2 方法

1.2.1 點(diǎn)板實(shí)驗(yàn) 取等量的酵母菌株新鮮培養(yǎng)物(A600值約為0.25)，無(wú)菌水倍比稀釋(1∶10)，取3.5 μL稀釋培養(yǎng)物滴入實(shí)驗(yàn)組YPD培養(yǎng)平板(含10 μg/mL熒光增白劑或100 μg/mL剛果紅)[7]。倒置30 ℃培養(yǎng)，從第2天起每隔12 h觀察菌落形態(tài)并拍照。3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行。制備300 μL YPD酵母菌株新鮮培養(yǎng)物(含10 μg/mL熒光增白劑或100 μg/mL剛果紅)，A600值約為0.04，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；每間隔2 h全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定培養(yǎng)物A600值。根據(jù)吸光度值，計(jì)算酵母菌株的細(xì)胞分裂增殖活性并繪制生長(zhǎng)曲線圖。3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。1.2.3 定量RT-PCR 將酵母菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集1 mL新鮮培養(yǎng)物(A600值約為2.5)，提取細(xì)胞總RNA、制備cDNA以及實(shí)時(shí)定量PCR，方法均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以酵母PRP8基因?yàn)閰⒈?，根?jù)2-ΔΔCT法計(jì)算細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下的克隆形成能力

為進(jìn)一步研究酵母菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑(熒光增白劑或剛果紅)的抵抗性，本研究觀察pmt1Δ菌株、ted1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下的細(xì)胞克隆形成能力。結(jié)果顯示：在YPD平板上，與野生型酵母細(xì)胞(BY4742)比較，pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯變化，ted1Δ菌株生長(zhǎng)較慢；在含熒光增白劑或剛果紅培養(yǎng)條件下，pmt1Δ菌株菌落形成較小，生長(zhǎng)較慢，菌株對(duì)藥物較敏感；ted1Δ菌株細(xì)胞生長(zhǎng)較快，有明顯抗性；但pmt1Δted1Δ菌株的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，表現(xiàn)出敏感性(圖1)。因此，缺失TED1基因增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性，進(jìn)一步缺失PMT1基因增強(qiáng)ted1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的敏感性。

圖1 酵母菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下的克隆形成能力

2.2 酵母菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下的增殖活性

通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，進(jìn)一步研究pmt1Δted1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑的抵抗性。結(jié)果顯示：在YPD液體培養(yǎng)條件下，與菌株BY4742平均約9 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比較，pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異，而ted1Δ菌株的生長(zhǎng)曲線低平，細(xì)胞生長(zhǎng)活力較差，約10.5 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在含10 μg/mL熒光增白劑培養(yǎng)條件下，與BY4742酵母細(xì)胞平均約17 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比較，pmt1Δ菌株的生長(zhǎng)緩慢(平均約19 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)；ted1Δ菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)較好(約14 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，pmt1Δted1Δ菌株生長(zhǎng)曲線低平，細(xì)胞活力最差，約26 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在含100 μg/mL剛果紅培養(yǎng)條件下，各菌株的細(xì)胞增殖能力情況與熒光增白劑培養(yǎng)條件下的結(jié)果相似(圖2)。因此，細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑影響菌株BY4742、pmt1Δ菌株、ted1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株的細(xì)胞分裂增殖能力，與對(duì)照組比較，ted1Δ菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)較好，但pmt1Δted1Δ菌株的生長(zhǎng)受明顯抑制。

圖2 酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中效應(yīng)蛋白在酵母菌株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

為研究pmt1Δ菌株、ted1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株參與細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路的可能機(jī)制，本文采用定量qRT-PCR檢測(cè)參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和完整性調(diào)控通路Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效應(yīng)蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：與BY4742比較，pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株中SLT2、MPT5和SSD1基因表達(dá)明顯升高，ted1Δ菌株中的基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化；與pmt1Δ菌株比較，pmt1Δted1Δ菌株中SLT2和MPT5基因表達(dá)明顯下調(diào)，SSD1基因表達(dá)無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖3)。

圖3 酵母菌株SLT2、SSD1和MPT5基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

因此，缺失PMT1上調(diào)野生型酵母細(xì)胞和ted1Δ菌株中細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。

3 討 論

酵母細(xì)胞壁對(duì)維持細(xì)胞形狀和完整性，以及促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外物理化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，誘導(dǎo)經(jīng)典細(xì)胞壁完整性(CWI)信號(hào)通路中蛋白激酶C-絲裂原活化蛋白激酶(PKC-MAPK)的激活，效應(yīng)蛋白Slt2p是這一信號(hào)通路中的重要成份，參與下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[2]，進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)錄因子Rlm1p的表達(dá)水平，調(diào)控β-葡聚糖和細(xì)胞壁相關(guān)成分轉(zhuǎn)錄，重構(gòu)細(xì)胞壁，賦予細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)抵抗能力[1，10]。與經(jīng)典CWI通路相平行的Mpt5p和Ssd1p兩條信號(hào)通路也參與調(diào)控細(xì)胞壁生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后加工，三條信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的完整性[2-3]。

通過(guò)研究缺失PMT1和(或)TED1基因在酵母細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的作用，進(jìn)而探討酵母細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)能力與細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示，已知長(zhǎng)壽命pmt1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑敏感，生長(zhǎng)較慢，形成較小克隆，這提示蛋白質(zhì)O-甘露糖基化修飾功能在細(xì)胞壁硬度和細(xì)胞完整性方面有著重要作用[11]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)缺失PMT1基因誘導(dǎo)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中效應(yīng)蛋白SLT2、MPT5和SSD1基因表達(dá)上調(diào)，這與以往研究結(jié)果PMT抑制劑能誘導(dǎo)CWI信號(hào)通路的活性相一致[11]。但是上調(diào)的保護(hù)性CWI信號(hào)通路沒(méi)有賦予pmt1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性，推測(cè)可能原因與蛋白質(zhì)甘露糖基化修飾功能缺陷影響PKC-MAPK信號(hào)通路的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞壁的完整性相關(guān)；另外，藥物刺激之后，細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)水平過(guò)高，超出pmt1Δ細(xì)胞可以承受的范圍，細(xì)胞壁重塑功能紊亂，對(duì)細(xì)胞造成生理毒性。pmt1Δ菌株在正常生理?xiàng)l件下的良好生長(zhǎng)狀態(tài)也說(shuō)明過(guò)高的細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)水平導(dǎo)致細(xì)胞損傷這一推測(cè)的可能性。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑對(duì)ted1Δ菌株和對(duì)照組酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，對(duì)后者的生長(zhǎng)抑制更加顯著，說(shuō)明缺失TED1基因增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性，提示Ted1p參與細(xì)胞壁硬度和(或)細(xì)胞完整性的調(diào)控。進(jìn)一步定量PCR結(jié)果顯示，ted1Δ菌株中細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路中效應(yīng)蛋白Slt2p、Ssd1p和Mpt5p轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無(wú)明顯變化，推測(cè)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路的活性可能更適合ted1Δ菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下的生長(zhǎng)；或者突變的鉀離子通道改變ted1Δ菌株細(xì)胞壁的通透性，影響藥物滲入，從而避免細(xì)胞損傷。已有研究報(bào)道Ted1p在調(diào)控酵母細(xì)胞壁穩(wěn)定性、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂等生理過(guò)程中具有重要的作用[4,13-14]，推測(cè)其他信號(hào)通路可能也會(huì)間接地參與ted1Δ菌株在細(xì)胞應(yīng)激條件下的細(xì)胞壁重構(gòu)功能。但是，缺失TED1基因增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)抵抗性的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

值得注意的是，細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑顯著抑制pmt1Δted1Δ菌株的生長(zhǎng)，提示缺失PMT1基因增強(qiáng)ted1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的敏感性；且pmt1Δted1Δ菌株誘導(dǎo)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路中效應(yīng)蛋白Slt2p、Ssd1p和Mpt5p轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)果提示pmt1Δted1Δ菌株參與細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)控，但誘導(dǎo)的PKC-MAPK、Mpt5p和Ssd1p三條保護(hù)性信號(hào)通路沒(méi)有賦予pmt1Δted1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性。推測(cè)缺失PMT1基因消弱ted1Δ菌株的細(xì)胞壁穩(wěn)定性或細(xì)胞壁通透性，進(jìn)而影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和其他生物學(xué)反應(yīng)[4,12-14]?？赡茉蚺c缺失Pmt1p和Ted1p影響蛋白質(zhì)O-甘露糖基化修飾功能，進(jìn)而干擾酵母細(xì)胞壁重構(gòu)，影響細(xì)胞的分裂增殖能力相關(guān)，或者Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá)不足以修復(fù)酵母細(xì)胞受到的細(xì)胞壁應(yīng)激損傷。總之，pmt1Δted1Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑敏感的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)已知長(zhǎng)壽命pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株中細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)，已知短壽命ted1Δ菌株中效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化。研究結(jié)果提示，上調(diào)的保護(hù)性信號(hào)通路沒(méi)有賦予菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性，說(shuō)明細(xì)胞分裂增殖能力與應(yīng)激反應(yīng)通路之間的關(guān)系較為復(fù)雜，這取決于細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)類型、脅迫程度和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂增殖能力通路等多因素的協(xié)同作用。因此，突變菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)抵抗性的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

致謝：感謝美國(guó)華盛頓大學(xué)Matt Keaberlein博士和美國(guó)BUCK衰老研究所Brian K Kennedy博士贈(zèng)送的菌株BY4742，及在酵母實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予的精心指導(dǎo)。