王志,胡仲皓,李思婷,桂雪兒,馮士彬,李玉,王希春,李錦春,吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036)

近年來,我國有些養(yǎng)鵝戶為使鵝快速生長選用粗蛋白含量相對較高的雞鴨飼料飼喂鵝,導(dǎo)致鵝蛋白質(zhì)代謝異常,引發(fā)雛鵝高尿酸血癥和痛風(fēng)[1]。高尿酸血癥和痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少所引起的一組異質(zhì)性疾病[2]。高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的最主要生化基礎(chǔ)[3],因此識別高尿酸血癥的特異性生物標(biāo)志物對高尿酸血癥及痛風(fēng)的診斷和治療具有重要意義。

代謝組學(xué)主要運(yùn)用核磁共振(NMR)光譜分析[4]、高效液相色譜/質(zhì)譜(HPLC/MS、LC/MS/MS)[5]和氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)[6]等檢測技術(shù),對有機(jī)物或生物樣品中的所有低分子量代謝物進(jìn)行定量分析。已有研究者通過代謝組學(xué)研究氧嗪酸鉀、酵母粉、高嘌呤飲食誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型[7-9],也有對高尿酸血癥患者和健康對照者開展的代謝組學(xué)研究[10],并確定出模型組生物標(biāo)志物。但目前尚缺乏用于禽類早期診斷、預(yù)測高尿酸血癥及痛風(fēng)進(jìn)展的生物標(biāo)志物,導(dǎo)致臨床上不能及時制定延緩和治療禽高尿酸血癥和痛風(fēng)進(jìn)展的干預(yù)措施。

因此,本試驗(yàn)通過超高效液相色譜四極桿飛行時間/質(zhì)譜法(LC-TOF/MS)和氣相色譜飛行時間/質(zhì)譜法(GC-TOF/MS)聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù),以及血清生化指標(biāo),分析高蛋白日糧對雛鵝血清內(nèi)外源性代謝產(chǎn)物和代謝通路的影響,揭示試驗(yàn)鵝所處的生理和病理狀態(tài),為篩選及鑒定高尿酸血癥和痛風(fēng)生物標(biāo)志物提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物分組及日糧

試驗(yàn)選用體重相近的1日齡雁鵝48只,隨機(jī)分成對照組(CP)和高蛋白組(HP),每組24只鵝?；A(chǔ)日糧參照鵝的營養(yǎng)需求制備,對照組飼喂粗蛋白含量為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的基礎(chǔ)日糧,高蛋白組飼喂粗蛋白含量為23%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的日糧。日糧的能量水平一致,日糧組成見表1。試驗(yàn)期為14 d。雛鵝自由采食,充足飲水,按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) g·kg-1

1.2 血清樣本采集及測定

每組選取10只鵝,分別于試驗(yàn)第7和14 天08:00開始頸靜脈采血2～3 mL。以血尿酸濃度高于476.57 mol·L-1作為高尿酸血癥判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。血液靜置20 min,離心抽取血清后將血清樣本分別保存于 -20 ℃冰箱及液氮罐里,用于后續(xù)的生化指標(biāo)及代謝組學(xué)檢測。血液生化指標(biāo)用全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定,參照試劑盒使用說明檢測血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)活性以及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、尿酸(UA)、尿素(UREA)、肌酐(CREA-S)含量。

1.3 非靶向代謝組學(xué)分析

1.3.1 樣品制備LC-TOF/MS樣品:取100 μL樣品至EP管中,加入300 μL甲醇(含內(nèi)標(biāo)1 μg·mL-1),渦旋混勻30 s,超聲10 min(冰水浴),-20 ℃靜置1 h;將樣品于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min;取上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測。所有樣品另取等量上清液混合成質(zhì)量控制(QC)樣品上機(jī)檢測。GC-TOF/MS樣品:取100 μL樣品至EP管中,加入300 μL甲醇(含內(nèi)標(biāo)1 μg·mL-1),渦旋混勻30 s,超聲10 min(冰水浴);將樣本于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min,移取180 μL上清液于1.5 mL EP管中。每個樣本各取 30 μL 混合成QC樣本,在真空濃縮器中干燥提取物;向干燥后的代謝物加入30 μL甲氧胺鹽試劑(溶于吡啶,20 mg·mL-1),輕輕混勻后,放入烘箱中80 ℃孵育30 min;向每個樣品中加入40 μL 雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA,含體積分?jǐn)?shù)1% 硅烷化試劑),將混合物70 ℃孵育1.5 h;冷卻至室溫后,向混合樣本中加入5 μL 溶于氯仿的脂肪酸甲酯(FAME),隨機(jī)上機(jī)檢測。

1.3.2 色譜和質(zhì)譜分析LC-MS/MS分析使用UHPLC系統(tǒng)(1290,Agilent),該系統(tǒng)帶有UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),與Q Exactive(Orbitrap MS,Thermo)耦合。流動相A為 0.1%甲酸(陽性)+5 mmol·L-1醋酸銨(陰性),流動相B為乙腈。洗脫梯度設(shè)置如下:0 min,1%B;1 min,1%B;8 min,99%B;10 min,99%B;10.1 min,1%B;12 min,1%B(%,體積分?jǐn)?shù))。流速0.5 mL·min-1,進(jìn)樣體積3 μL。在 LC/MS 試驗(yàn)中,QE質(zhì)譜儀用于獲取基于信息依賴基礎(chǔ)(IDA)的MS/MS光譜。在此模式下,用采集軟件(Xcalibur 4.0.27,Thermo)采集全掃描測量MS數(shù)據(jù)時,根據(jù)預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)評估并觸發(fā)MS/MS光譜的采集。

采用Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行GC-TOF/MS分析。系統(tǒng)采用DB-5MS毛細(xì)管柱。以無分流模式注入1 μL樣品。氦氣作為載氣,前入口吹掃流量為3 mL·min-1,通過塔的氣體流量為1 mL·min-1。初始溫度50 ℃,保持1 min,然后以20 ℃·min-1的速率升高到310 ℃,保持6 min。注入、傳輸線和離子源溫度分別為280、280和250 ℃。在電子碰撞模式下能量為-70 eV。在溶劑延遲4.83 min后,以每秒12.5光譜的速率在50～500m/z以全掃描模式獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 血清生化指標(biāo)

如表2所示:與對照組(CP)相比,雛鵝7日齡和14日齡時,高蛋白組(HP)鵝血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶活性和總蛋白、尿酸含量極顯著升高(P<0.01),球蛋白含量顯著升高(P<0.05);雛鵝14日齡時,高蛋白組鵝血清中總膽紅素、間接膽紅素、尿素、肌酐含量極顯著升高(P<0.01),高蛋白組血清尿酸平均水平為738 mmol·L-1,表明用高蛋白日糧成功構(gòu)建高尿酸血癥模型。

表2 高蛋白飼糧對雛鵝血清生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of high protein diet on serum biochemical indexes in goslings

2.2 14日齡鵝血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

從2組雛鵝主成分分析(PCA)得分圖(圖1)可見:樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi),2組樣本分離成 2個不同的簇。為了鑒別HP組與CP組血清代謝物的差異,采用正交偏最小二乘-判別分析法(DPLS-DA)對結(jié)果進(jìn)行分析,得出OPLS-DA評分散點(diǎn)圖。從OPLS-DA散點(diǎn)圖觀察到樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi),2組間有明顯的分離趨勢,提示HP組與CP組血清代謝譜有差異。對于LC-TOF/MS試驗(yàn),根據(jù)投影中的可變重要度(VIP)值大于1,P<0.01,差異倍數(shù)≤0.833 3或≥1,共選擇27種代謝物(表3)。對于 GC-TOF/MS試驗(yàn),同上條件下共鑒定出13種代謝物(表4)。然后,基于pathway數(shù)據(jù)庫和代謝分析系統(tǒng),通過代謝富集和途徑分析,將這些不同的代謝產(chǎn)物映射到它們的生化途徑中。如圖2所示:基于LC-TOF/MS和GC-TOF/MS分析結(jié)果,顯著改變的途徑有氨酰tRNA生物合成、嘌呤代謝、嘧啶代謝、β-丙氨酸代謝、賴氨酸降解、磷酸肌醇代謝、泛酸和輔酶A生物合成。

圖1 HP組與CP組代謝譜的PCA模型得分散點(diǎn)圖(A)和OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖(B)Fig.1 Score scatter plot of PCA model(A)and OPLS-DA model(B)for HP and CP groups

表3 LC-TOF/MS分析HP組與CP組雛鵝代謝產(chǎn)物的差異Table 3 Discrepant serum metabolites identified by LC-TOF/MS analysis between HP and CP groups in goslings

續(xù)表3 Table 3 continued

圖2 HP與CP組代謝通路分析Fig.2 Analysis of metabolic pathways in HP and CP groupsA.氨酰tRNA生物合成 Aminoacyl-tRNA biosynthesis;B. 賴氨酸降解 Lysine degradation;C. 嘌呤代謝 Purine metabolism;D. 嘧啶代謝 Pyrimidine metabolism;E. 磷酸肌醇代謝 Inositol phosphate metabolism;F. β-丙氨酸代謝Beta-alanine metabolism;G. 泛酸和輔酶A生物合成 Pantothenate and CoA biosynthesis.

表4 GC-TOF/MS分析HP組與CP組雛鵝代謝產(chǎn)物的差異Table 4 Discrepant serum metabolites identified by GC-TOF/MS analysis between HP and CP groups in goslings

利用熱圖形象化顯示了鑒別到的41個差異代謝物在對照組與高蛋白組中相對含量及變化趨勢(圖3)。由圖3可見:與對照組相比,高蛋白組差異代謝物顏色顯著不同,說明高蛋白組和對照組差異代謝物含量不同。

圖3 HP與CP組鵝血清中差異代謝物相對含量的熱圖分析Fig.3 Heatmap based on the relative levels of different metabolites in serum samples of goslings in the HP and CP groupsD.1-D.10:CP group 1-10 samples;S.1-S.10:HP group 1-10 samples.

3 討論

禽類由于肝臟缺乏精氨酸酶,所以從飼料中攝入的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的核酸及嘌呤類物質(zhì)最終代謝產(chǎn)物是尿酸。長期高蛋白攝入會導(dǎo)致蛋白質(zhì)代謝異常,尿酸生成增多,當(dāng)機(jī)體無法及時排除尿酸,體內(nèi)積聚的高濃度尿酸可引起腎損傷,腎小管過濾尿酸的能力下降,導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生[12]。血清生化檢測結(jié)果表明高蛋白組總蛋白、尿酸含量極顯著升高,證實(shí)高蛋白日糧的攝入已導(dǎo)致本試驗(yàn)雛鵝血液中蛋白含量升高,尿酸生成增多,且尿酸的平均濃度達(dá)到高尿酸水平,使攝食高蛋白雛鵝患上高尿酸血癥。家禽腎臟中含有少量的精氨酸酶,能從血漿中獲取精氨酸,通過精氨酸酶催化產(chǎn)生尿素[13]。在正常情況下,禽類的尿素幾乎能全部被腎臟濾過。本試驗(yàn)中高蛋白組雛鵝尿素含量顯著升高,原因可能是高蛋白日糧為尿酸的合成提供了更多尿素合成的原料,尿素不能及時排出體外;也可能是高濃度尿酸引起腎損傷,導(dǎo)致尿素在體內(nèi)滯留。血清總膽紅素包括直接膽紅素和間接膽紅素,它是肝功能的重要指標(biāo)[14],引起總膽紅素升高的原因主要有膽道梗阻、肝細(xì)胞受損等。ALT、AST、LDH活性反映肝細(xì)胞的完整性,常被視為肝損傷的敏感指標(biāo)[15-16]。血清生化檢測結(jié)果顯示,試驗(yàn)第14天,高蛋白組的血清總膽紅素濃度顯著升高,而ALT、AST活性上升,說明高蛋白組雛鵝存在肝臟損傷,應(yīng)是肝細(xì)胞受損導(dǎo)致肝臟處理膽紅素的能力下降。

本試驗(yàn)中精氨酸、肌酸、尿囊素、瓜氨酸、尿素、肌酐含量均有上升趨勢,而家禽精氨酸及肌酸代謝會產(chǎn)生尿素和肌酐[17],表明攝入高蛋白導(dǎo)致精氨酸及肌酸代謝增強(qiáng),產(chǎn)生過多的尿素和肌酐,肌酐含量增加原因可能與尿素相似。因此,對于構(gòu)建高蛋白日糧雛鵝高尿酸模型時,不能簡單認(rèn)為尿素和肌酐含量的增加意味著腎功能的損傷。尿囊素和瓜氨酸被認(rèn)為是氧化應(yīng)激和腎臟代謝標(biāo)志物[18-19],其水平增加表明氧化應(yīng)激的增加,腎臟代謝異常。雖然尿囊素和瓜氨酸增加的原因可能與尿素相似,但是有研究證實(shí)高尿酸可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激致腎臟損傷[20],腎臟作為尿酸排泄主要的器官[21],隨著高蛋白的持續(xù)攝入,尿酸代謝平衡會隨著飼喂時間的增加而越來越紊亂,因此高蛋白日糧誘導(dǎo)的雛鵝高尿酸血癥很有可能是由于腎臟尿酸排泄障礙所引發(fā)的[18]。

尿酸是嘌呤核苷酸代謝產(chǎn)生的,黃嘌呤核苷酸和黃嘌呤是嘌呤代謝中尿酸的前體,而R-核糖可以加快機(jī)體嘌呤核苷酸的合成[22]。本試驗(yàn)中,R-核糖、黃嘌呤核苷酸和黃嘌呤含量有上升趨勢,尿酸前體水平升高及血清尿酸含量增多提示在高蛋白組雛鵝中嘌呤代謝過度激活,嘌呤代謝異常。有研究證實(shí),嘌呤降解增加與高尿酸血癥密切相關(guān),尿酸在高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[23]。由此我們推測R-核糖、黃嘌呤核苷酸、黃嘌呤及尿酸極有可能是高尿酸血癥的潛在標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥與氨酰tRNA生物合成代謝的紊亂密切相關(guān)[24-25]。本試驗(yàn)高尿酸血癥雛鵝血清中纈氨酸、賴氨酸、L-天冬酰胺、L(+)-精氨酸等氨基酸及氨酰tRNA生物合成也有上調(diào)趨勢,可能與飼喂的高蛋白日糧有關(guān),也有可能與高尿酸的形成有關(guān),還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述,本試驗(yàn)通過飼喂高蛋白日糧成功建立雛鵝高尿酸模型,采用LC-TOF/MS和GC-TOF/MS研究患高尿酸血癥雛鵝和健康對照組雛鵝血清樣品的非靶向代謝組學(xué),發(fā)現(xiàn)高蛋白組雛鵝血清中黃嘌呤、1-甲基鳥苷、5,6-二氫尿嘧啶、瓜氨酸、尿酸等41種代謝物含量較對照組均發(fā)生明顯改變,提示上述代謝物與高蛋白日糧誘導(dǎo)雛鵝高尿酸血癥發(fā)生相關(guān),為其潛在標(biāo)志物。