王明發(fā),王浩宇,王浩,袁林*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.舞鋼市鴻發(fā)禽業(yè)有限公司,河南 舞鋼 462500)

雞體脂肪主要沉積在腹部、皮下和肌肉組織等部位[1-2]。肌內(nèi)脂肪(IMF)主要分布在肌表層、肌周和肌內(nèi)膜,是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。一定量的IMF可以提高肌肉的風(fēng)味和嫩度等品質(zhì)[3-8],IMF含量增加可減少肌肉滴水損失和蒸煮損失,因而改善肉質(zhì)[9]。因此需要對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制進(jìn)行研究。脂肪酸是機(jī)體重要的能量來源,多余的脂肪酸可以作為脂肪在體內(nèi)儲(chǔ)存。在現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖中,機(jī)體內(nèi)脂肪沉積過多是養(yǎng)殖者關(guān)注的問題。因?yàn)槿怆u體內(nèi)脂肪沉積過多,不僅導(dǎo)致飼料效率下降,而且大部分脂肪作為邊角料在屠宰和加工過程中被舍棄,造成浪費(fèi)[10]。哺乳類單胃動(dòng)物多數(shù)脂肪酸的合成開始于脂肪組織,而雞的脂肪代謝則不同,脂肪組織中很少甚至幾乎沒有脂肪酸合成,脂肪組織中90% 以上的脂肪酸是在肝臟中合成的[10-12]。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的關(guān)鍵多功能酶[13]。動(dòng)物體內(nèi)FASmRNA表達(dá)水平與體脂含量呈正相關(guān)[14]。組織中脂肪酸合成的最高水平由FASmRNA表達(dá)水平?jīng)Q定[15]。在豬和大鼠等哺乳動(dòng)物中,已有一些關(guān)于IMF含量和FASmRNA表達(dá)水平之間關(guān)系的研究[5,16-18]。然而,雞FASmRNA的表達(dá)模式及其與IMF和脂肪沉積的關(guān)系尚不清楚。固始雞是我國著名的地方雞種,具有生長(zhǎng)緩慢、肉質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn),AA肉仔雞是快速生長(zhǎng)肉仔雞的代表。相關(guān)研究表明,8周齡固始雞胸肌中IMF含量顯著高于AA肉雞,但腿肌中含量沒有顯著差異[19],而不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FASmRNA表達(dá)及活性的研究還鮮見報(bào)道?；ㄉ南┧嶙鳛橐环N重要的風(fēng)味物質(zhì),其含量顯著影響雞肉品質(zhì)。本研究通過測(cè)定不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中的IMF含量及脂肪酸組成,研究固始雞和AA肉雞不同周齡肝臟中脂肪酸合成酶活性及FASmRNA表達(dá)的規(guī)律,對(duì)于闡明固始雞高品質(zhì)雞肉形成的分子機(jī)制具有重要意義,同時(shí)也為固始雞日糧中脂肪配比水平的調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、日糧和分組

選取1日齡快長(zhǎng)型D系固始雞(固始三高集團(tuán)提供)和AA肉雞(購自開封正大種雞場(chǎng))公雛各200只,每個(gè)品種的雛雞隨機(jī)分成5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)40只雞。選用玉米-豆粕型日糧,分1～4周齡和5～6周齡2個(gè)飼養(yǎng)階段,營養(yǎng)水平參照美國營養(yǎng)研究委員會(huì)(1994)肉仔雞的營養(yǎng)需要配制日糧,基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。雞群飼養(yǎng)和免疫按正常程序進(jìn)行,保證充足光照時(shí)間,試驗(yàn)雞用籠具為不銹鋼材料,飼槽和飲水設(shè)備為塑料制品。

表1 不同飼養(yǎng)階段基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)組成水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Basic diet composition and nutrient composition at the different feeding stages(air-dry basis) %

1.2 采樣

試驗(yàn)開始第1天取樣(設(shè)為0周齡),然后分別在3、4、5和6周齡不禁食狀態(tài)下(禁食會(huì)影響FAS水平)從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取體重相近的3只雞頸部放血宰殺,采集約1 g肝樣置于凍存管中,液氮速凍,然后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存,用于測(cè)定FASmRNA表達(dá)水平。其余肝臟樣本裝入聚乙烯袋中,封口,于-20 ℃保存,用于分析FAS活性。采集4和6周齡左側(cè)胸肌和腿肌樣本,-20 ℃保存,用于測(cè)定肌肉中脂肪酸組成和脂肪含量。

1.3 胸肌和腿肌中IMF含量的測(cè)定

取每個(gè)肌肉樣品約2 g,先去除明顯的脂肪,解凍后切碎,65 ℃干燥12 h后轉(zhuǎn)至105 ℃繼續(xù)干燥12 h,然后在干燥器中冷卻30 min,以無水乙醚為溶劑,采用索氏抽提法測(cè)定腿肌和胸肌中脂肪含量。

1.4 肝臟中FAS活性的測(cè)定

用 FAS酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測(cè)定肝臟中FAS活性。稱取 -20 ℃保存的肝臟組織10 mg,加入100 μL 9 g·L-1生理鹽水中,搗碎、勻漿,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液備用。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL;在酶標(biāo)包被板孔中先加樣品稀釋液40 μL,再加待測(cè)樣品10 μL;除空白外,每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL;用封板膜封板后37 ℃溫育60 min;洗滌液洗滌 5次,甩干;每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL,37 ℃避光顯色15 min;每孔加終止液 50 μL,終止反應(yīng);用酶標(biāo)儀(Infinite F50)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(A450值),計(jì)算樣品脂肪酸合成酶活性(U·mg-1)。

1.5 肝臟中FAS mRNA水平的測(cè)定

取-80 ℃冰箱中保存的肝臟組織約100 mg,用Trizol試劑提取RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260、D280值并計(jì)算D260/D280值,計(jì)算RNA的純度和濃度,瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量。取4.782 μg樣品RNA,在20 μL的反應(yīng)體系中42 ℃反應(yīng)60 min,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。從GenBank中查找FAS和β-actinmRNA的全序列,設(shè)計(jì)基因引物序列:β-actin(161 bp):5′-AGAAGGAGATCACAGCCCT-3′/5′-GGGTCCGGATTC-ATCGTACT-3′;FAS(119 bp):5′-GGACCTTATCGCATTGCTGG-3′/5′-TTTCCTTGGGTCAGCTTTGC-3′。由武漢巴菲爾(Biobuffer)生物技術(shù)有限公司合成。

RT-qPCR檢測(cè)(25 μL反應(yīng)體系):0.5 μL內(nèi)參 F(10 μmol·L-1),0.5 μL內(nèi)參 R(10 μmol·L-1),2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1),0.25 μLExTaq,2.5 μL 10×ExTaqE 緩沖液,1 μL cDNA,18.25 μL ddH2O。反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 4 min。RT-qPCR檢測(cè)時(shí),cDNA 6倍稀釋,20 μL反應(yīng)體系如下:4 μL cDNA(6倍稀釋),0.4 μL上游引物(100 μmol·L-1),0.4 μL下游引物(100 μmol·L-1),10 μL SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix,5.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以0.5 ℃·s-1從60 ℃升溫至95 ℃,繪制熔解曲線,再以2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.6 胸肌和腿肌中脂肪酸組成測(cè)定

胸肌和腿肌中脂肪酸組成的測(cè)定采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定GB 5009.168—2016》第三法。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件中的混合線性模型對(duì)肝臟中FASmRNA表達(dá)水平、FAS活性及肌肉中IMF含量進(jìn)行分析。品種、周齡和品種×周齡作為固定效應(yīng),雞作為隨機(jī)效應(yīng),以周齡作為重復(fù)測(cè)量,雞肝臟中FASmRNA表達(dá)水平、FAS活性及肌肉中IMF含量作為協(xié)變量。由于某些脂肪酸在特定組織中的含量未測(cè)出,因此,只對(duì)胸肌和腿肌中部分脂肪酸采用t測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FAS mRNA表達(dá)水平分析

從表2可以看出:AA肉雞肝臟中FASmRNA表達(dá)水平顯著高于固始雞。品種與周齡互作對(duì)表達(dá)水平產(chǎn)生極顯著影響,對(duì)相同周齡FASmRNA表達(dá)水平比較發(fā)現(xiàn),0、3和5周齡時(shí),AA肉雞肝臟中FASmRNA表達(dá)水平顯著高于固始雞,而4和6周齡時(shí)品種間沒有顯著差異。

2.2 不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性分析

從表3可以看出:AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性沒有顯著差異。品種與周齡互作對(duì)FAS活性產(chǎn)生極顯著影響,對(duì)相同周齡FAS活性比較發(fā)現(xiàn),在0、3和和5周齡時(shí),AA肉雞顯著高于固始雞,4和6周齡時(shí),品種間沒有顯著差異,這與FASmRNA表達(dá)水平相一致;從0 到5周齡,AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性沒有顯著變化,6周齡時(shí)兩品種肉雞肝臟中FAS活性顯著提高。

表3 不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性Table 3 Liver FAS activity of AA broiler and Gushi chicken of different week-age

2.3 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量分析

從表4可以看出:AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量極顯著高于固始雞。品種與周齡互作對(duì)胸肌中IMF含量產(chǎn)生顯著影響,對(duì)腿肌中IMF含量不產(chǎn)生顯著影響。對(duì)相同周齡IMF含量比較發(fā)現(xiàn),4周齡時(shí),AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量均顯著高于固始雞;6周齡時(shí),AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量與固始雞沒有顯著差異。

表4 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量Table 4 IMF contents in breast and leg muscles of AA broilers and Gushi chicken of different week-age

2.4 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸組成分析

從表5可以看出:相同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸總含量沒有顯著差異。脂肪酸組成方面品種間呈現(xiàn)顯著差異,無論是胸肌還是腿肌,固始雞多不飽和脂肪酸含量顯著高于AA肉雞;4周齡固始雞胸肌和腿肌中亞油酸含量顯著高于AA肉雞,6周齡時(shí)差異不顯著;4周齡時(shí)AA肉雞胸肌中亞麻酸含量顯著高于固始雞,腿肌中沒有顯著差異,6周齡時(shí)AA肉雞胸肌和腿肌中亞麻酸含量顯著高于固始雞,4和6周齡時(shí)固始雞胸肌和腿肌中花生四烯酸含量顯著高于AA肉雞。隨著周齡增加,AA肉雞胸肌和腿肌中多不飽和脂肪酸含量沒有顯著變化,而固始雞含量顯著降低;AA肉雞4周齡胸肌和腿肌中亞油酸含量與6周齡沒有顯著差異,而固始雞胸肌和腿肌中亞油酸含量隨著周齡增加顯著降低;與4周齡相比,6周齡AA肉雞胸肌中亞麻酸含量顯著提高,腿肌中沒有顯著變化,固始雞胸肌中亞麻酸含量沒有顯著差異,而腿肌中含量顯著降低;AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中花生四烯酸含量隨周齡增加均無顯著變化。

表5 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸組成Table 5 Fatty acid composition in breast and leg muscles of AA broiler and Gushi chicken of different week-age(w)

3 討論

3.1 AA肉雞和固始雞肝臟中FAS mRNA表達(dá)水平

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,在雞肝臟中以復(fù)雜的七步反應(yīng)將乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS活性和表達(dá)水平與雛雞肝臟中脂肪酸合成的速度有關(guān),FASmRNA表達(dá)量的變化直接與FAS蛋白的合成速度正相關(guān)[20-22]。本研究結(jié)果顯示,AA肉雞肝臟中FASmRNA表達(dá)水平顯著高于固始雞;0、3和5周齡時(shí)AA肉雞肝臟中FASmRNA表達(dá)水平顯著高于固始雞,4和6周齡時(shí)盡管差異不顯著,但AA肉雞的表達(dá)水平有高于固始雞的趨勢(shì),這與Zhao等[23]的結(jié)果一致。此外,Daval等[24]和Douaire等[25]報(bào)道,遺傳性多脂系和瘦型系肉雞的FASmRNA表達(dá)水平存在差異,但由于個(gè)體間的變異系數(shù)較大,統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異不顯著。

3.2 AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性

本研究結(jié)果表明,在0、3和5周齡時(shí),AA肉雞肝臟中FASmRNA表達(dá)水平顯著高于固始雞,同階段AA肉雞肝臟中FAS活性亦顯著高于固始雞;4和6周齡時(shí)AA肉雞的表達(dá)量與固始雞沒有顯著差異,FAS活性表現(xiàn)出相同趨勢(shì)。這與Richard等[26]的研究結(jié)果一致,肝臟中FASmRNA表達(dá)量與FAS活性間呈正相關(guān)關(guān)系。

3.3 AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量差異與FAS mRNA表達(dá)水平的關(guān)系

肌間脂肪含量直接影響肉品風(fēng)味、多汁性和口感,是判定肉質(zhì)的重要指標(biāo);在影響IMF的眾多因素中,遺傳因素對(duì)IMF含量影響較大。本研究中,4周齡時(shí)AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量顯著高于固始雞,6周齡時(shí)AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量與固始雞沒有顯著差異。這與王志祥等[19]的研究結(jié)果不同,他們測(cè)定了8周齡艾維茵肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量,發(fā)現(xiàn)固始雞胸肌中IMF含量顯著高于艾維茵肉雞,而腿肌中沒有顯著差異,可能與測(cè)定的周齡有關(guān)。從4周齡到6周齡,AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量顯著降低,而固始雞腿肌中IMF含量沒有顯著變化,這可能與2個(gè)品種肉雞在此生長(zhǎng)階段內(nèi)的增重速率有關(guān),AA肉雞在4周齡到6周齡期間絕對(duì)增重為1 120 g,而固始雞只有598 g[27],脂肪沉積速度低于增重速度,隨著飼養(yǎng)周期延長(zhǎng),固始雞胸肌和腿肌中IMF含量可能會(huì)高于AA肉雞。

本研究中,與4周齡相比,6周齡時(shí)除固始雞的腿肌中IMF含量增加外,AA肉雞胸肌、腿肌和固始雞胸肌中IMF含量均顯著降低,這與肝臟中FAS活性及mRNA水平的變化并不一致,可能與不同周齡的雞IMF變化滯后于肝臟FAS活性的變化有關(guān)。機(jī)體利用能量等合成脂肪的能力是逐漸增加的,而前期由于生長(zhǎng)發(fā)育的需要,雞肉脂肪沉積較少[28],只有當(dāng)脂肪酸的攝取速度大于脂肪酸氧化速度時(shí),脂質(zhì)才會(huì)在肌肉組織中進(jìn)行沉積,從而形成IMF[29]。脂肪在機(jī)體組織內(nèi)的沉積與分配主要受到激素和脂肪代謝相關(guān)酶活性的調(diào)控,肝臟是家禽合成脂肪的主要部位,家禽90% 以上的脂肪酸在肝臟內(nèi)合成,因此肝臟內(nèi)脂肪代謝酶活性的高低直接影響了脂肪在組織內(nèi)的沉積與分配,雞肝臟內(nèi)FAS活性雖然對(duì)肌肉IMF含量具有重要作用,但這在90～200日齡的生長(zhǎng)階段更為明顯[30]。有研究表明河田雞、烏雞和北京油雞在8～16周齡階段胸肌和腿肌IMF含量會(huì)隨著周齡的增加而顯著升高[31]。AA肉雞與北京油雞在28～90日齡階段胸肌和腿肌IMF含量也隨日齡的增加呈上升趨勢(shì)[28]。

3.4 AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸組成差異

雞肉中脂肪酸組成直接影響雞肉的風(fēng)味。研究發(fā)現(xiàn),花生四烯酸是前列腺素和凝血酶的前體,可影響血凝和愈合過程,同時(shí)在幼兒生長(zhǎng)中也扮演著重要的角色[32];亞麻酸和亞油酸對(duì)人體起著至關(guān)重要的作用,但都必須直接攝入,無法在體內(nèi)合成[33]。本研究中,AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸總量沒有顯著差異,但相同周齡時(shí),固始雞胸肌、腿肌中亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸總量顯著高于AA肉雞。花生四烯酸為雞肉中最重要的香味前體物質(zhì)之一,4周齡時(shí),固始雞胸肌和腿肌中花生四烯酸含量分別為AA肉雞的2.09、4.03倍,6周齡時(shí)為分別為3.17和3.91倍,這可能是固始雞具有特殊風(fēng)味的重要原因。

綜上,品種間FASmRNA表達(dá)水平及FAS活性的差異可能是造成肉雞生長(zhǎng)前期IMF含量顯著不同的原因之一;胸肌和腿肌中多不飽和脂肪酸,特別是花生四烯酸含量可能是影響固始雞雞肉風(fēng)味的重要因素。