鄒顏紅 祁愛蓉 徐緣釗 羅登貴 劉宴娟 凌舒藝 傅 博

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院腎病科，廣東省深圳市 518033，電子郵箱：1635765703@qq.com)

中藥雷公藤，其性寒涼，味苦、辛、澀，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、解毒等功效?，F(xiàn)代研究表明，雷公藤含有生物堿、萜類化合物、衛(wèi)矛醇等多種生物活性物質(zhì)，雷公藤甲素是其主要有效成分[1]。目前，臨床上廣泛使用雷公藤制劑治療腎病綜合征、糖尿病腎病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種免疫性疾病，具有較好的療效。但同時其對肝臟、腎臟、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等會造成一定的損傷，尤其是對生殖系統(tǒng)的毒性作用使得雷公藤制劑的臨床應(yīng)用受到很大限制[2-3]。因此，近年來雷公藤制劑的生殖毒性成為研究熱點之一。

淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要有效成分之一，它是一種黃酮類化合物，具有雌激素樣作用，能夠促進性激素分泌，延緩性腺衰老[4-5]。三七總皂苷是從中藥三七中提取的有效活性成分，具有清除自由基、抗氧化、延緩衰老、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等功能[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[7]，聯(lián)合應(yīng)用淫羊藿苷和三七總皂苷對大鼠睪丸的生殖功能衰退有改善作用，但兩者聯(lián)合使用是否可以改善卵巢生殖功能的損傷，鮮有研究報告。本研究通過建立雷公藤甲素誘導(dǎo)SD大鼠卵巢損傷模型，初步探討雷公藤甲素對卵巢的毒性，以及淫羊藿苷聯(lián)合三七總皂苷對卵巢功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 雷公藤甲素(貨號：PCS0576)購自中國成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；淫羊藿苷(批號：PIKX-771H)、三七總皂苷(批號：GF49-NH59)均購自中國食品藥品檢定研究院；胎牛血清(批號：WXBD0055V)購自美國Sigma公司；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)/F12完全培養(yǎng)液(批號：2020046)購自Biological Industries公司；青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)(批號：1989511)購自美國Gibco公司；生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG(批號：SA1055)購自武漢博士德生物工程有限公司，過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號：96203)購自上海翊圣生物科技有限公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(批號：C0105)、CCK-8試劑盒(批號：C0038)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；10%水合氯醛溶液(批號：DC04BA0020)購自BBI Life Sciences公司；4%多聚甲醛溶液(批號：70085400)購自Biosharp Life Sciences；TritonX-100溶液(批號：100M0128V)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO，批號：SHBB5172V)均購自美國Sigma公司；乙醇(批號：20200530)購自廣東光華科技股份有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS，批號：AF29511327)購自美國HyClone公司；二甲苯溶液(批號：C12019254)購自上海麥克林生化科技有限公司；透明質(zhì)酸酶(貨號：H6254)購自Sigma-Aldrich公司。多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司，型號：Synergy HIM)、離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：TDZ4-WS)、顯微鏡(日本尼康公司，型號：Ts2)、CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電機株式會社，型號：MC0-18AIC)、超凈工作臺(上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：OptiClean1300)。

1.2 實驗動物與分組 18只8～9周齡雌性SD大鼠，體重約250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[動物許可證號SCXK(粵)2018-0002]。將大鼠飼養(yǎng)在溫度22℃～25℃、相對濕度55%～65%、12 h光照/12 h黑暗周期的房間內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)約7 d后進行實驗。使用隨機數(shù)字表將大鼠分為正常對照組、模型組和治療組3組，每組6只。正常對照組每日以含5% DMSO的生理鹽水灌胃，模型組每日以雷公藤甲素50 μg/kg(溶于含5% DMSO的生理鹽水中)灌胃，治療組則每日以雷公藤甲素50 μg/kg+淫羊藿苷30 mg/kg+三七總皂苷30 mg/kg(溶于含5% DMSO的生理鹽水中)灌胃，灌胃體積均為10 mL/(kg·d)，1次/d。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)本留?。哼B續(xù)灌胃6個月后，以10%水合氯醛溶液(0.3～0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠迅速浸入75%酒精中約5 s，移入超凈工作臺，無菌條件下進行解剖，觀察并拍照記錄卵巢形態(tài)，迅速剝離摘取雙側(cè)卵巢，進行后續(xù)實驗。

1.3.2 卵巢病理切片與卵泡計數(shù)：將一側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛固定液中，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察卵巢病理組織形態(tài)改變，并參照Myers等[8]提出的卵泡分類方法進行卵泡計數(shù)。

1.3.3 原代卵巢顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：在超凈工作臺上將另一側(cè)卵巢用PBS反復(fù)沖洗，使用1 mL注射器針頭挑出成熟卵泡，刺破卵泡使卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞釋放,置于培養(yǎng)液中，用吸管吹打分散成單個懸浮細(xì)胞；加入500 μL透明質(zhì)酸酶，孵化30 min；離心(800 r/min，5 min)后小心吸去適量上清液，反復(fù)兩次后進行反復(fù)吹打，將顆粒細(xì)胞吹打成細(xì)胞混懸液，加入0.25%胰酶消化3～5 min，再次離心(800 r/min，5 min)后棄去上清液；將DMEM/F12完全培養(yǎng)液加入底物中，再次離心(1 000 r/min，5 min)后，棄去適量上清液，收集顆粒細(xì)胞。用含10%的胎牛血清及1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基將顆粒細(xì)胞的濃度調(diào)為5×105/mL，接種于24孔細(xì)胞孔板，1 mL/孔，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進行后續(xù)實驗。

1.3.4 原代卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)鑒定：取正常對照組原代卵巢顆粒細(xì)胞進行形態(tài)鑒定。(1)HE染色。細(xì)胞爬片3張，固定液固定10 min以上，蒸餾水洗滌2 min；蘇木素染色液染色5～10 min，浸入自來水中沖洗去除多余的染色液約10 min，蒸餾水再洗滌1遍(數(shù)秒)，伊紅染色液染色30 s至2 min(可根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整時間)。按照下述順序進行脫水、透明、封片：70%乙醇10 s、80%乙醇10 s、90%乙醇10 s、無水乙醇10 s、二甲苯透明5 min；換用新鮮的二甲苯，再透明5 min；用中性樹膠或其他封片劑封片；顯微鏡下觀察，并拍照記錄。(2)細(xì)胞免疫組化染色。細(xì)胞爬片3張，用PBS漂洗3次，2 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，干燥后用PBS漂洗3次，2 min/次；用0.5%的TritonX-100溶液孵育20 min，用PBS漂洗3次，2 min/次；再用3%的H2O2孵育15 min，用PBS漂洗3次，2 min/次；用牛血清白蛋白封閉20 min，甩掉封閉液，滴加一抗(生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG)，4℃過夜后，用PBS漂洗3次，5 min/次；滴加二抗(過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)，37℃下孵育30 min，用PBS漂洗5次，2 min/次；二氨基聯(lián)苯胺顯色(避光)約10～15 min，水洗5 min。蘇木素復(fù)染10 min，自來水洗5 min；脫水、透明、樹膠封片、鏡下觀察、攝片及分析。

1.3.5 CCK-8法檢測卵巢顆粒細(xì)胞的活力：取1×105/mL顆粒細(xì)胞接種于96孔板中，100 μL/孔，每組設(shè)置6個復(fù)孔；于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h以上，待細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，孵育1 h后于酶標(biāo)儀上檢測450 nm處的吸光值。吸光值越大細(xì)胞活力越強。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊者采用單因素方差分析進行組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis 檢驗進行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組卵巢組織形態(tài) (1)解剖形態(tài)：正常對照組肉眼下觀察可見卵巢潮紅柔軟，表面較光滑；而模型組可見卵巢體積變小，顏色灰白，表面皺縮，質(zhì)地較堅硬；治療組可見卵巢體積稍小，顏色蒼白，表面略皺縮。見圖1。(2)病理形態(tài)：HE染色提示正常對照組大鼠卵巢體積與結(jié)構(gòu)正常，可見各級卵泡廣泛分布，卵泡液含量多，顆粒細(xì)胞層次較多；而模型組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的破壞，生長期卵泡(包括初級卵泡、次級卵泡)以及成熟卵泡數(shù)量較正常對照組減少，閉鎖卵泡數(shù)量明顯增多，卵泡顆粒細(xì)胞層次明顯變薄；治療組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)則未見明顯改變，各級卵泡數(shù)量與正常對照組間無明顯差異。見圖2。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)

圖2 各組卵巢病理切片 (HE染色，×40)

2.2 各組大鼠卵泡計數(shù) 以閉鎖卵泡和成熟卵泡為代表，進行卵泡計數(shù)。與正常對照組和治療組相比，模型組大鼠卵巢閉鎖卵泡數(shù)量增多(均P<0.05)，正常對照組與治療組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常對照組相比，模型組和治療組的成熟卵泡計數(shù)均減少(均P<0.05)，模型組與治療組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠卵泡計數(shù)的比較(x±s，個)

2.3 正常對照組原代卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)鑒定結(jié)果 (1)HE染色：在鏡下可見貼壁細(xì)胞體積較大，形態(tài)完整，邊緣清晰，大小均勻，呈梭形或多角形，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核染色呈深藍色，卵圓形或不規(guī)則形位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。與文獻報道的形態(tài)一致[9]。見圖3。(2)細(xì)胞免疫組化染色：在鏡下可見貼壁細(xì)胞形態(tài)較完整，呈梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色均勻呈棕褐色，高倍鏡下可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布細(xì)密的顆粒狀物。見圖4。

圖3 卵巢顆粒細(xì)胞HE染色

圖4 卵巢顆粒細(xì)胞免疫組化染色

2.4 各組卵巢顆粒細(xì)胞活力 模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活力低于正常對照組(P<0.05)；治療組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活力較模型組有所上升(P<0.05)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組卵巢顆粒細(xì)胞吸光值的比較(x±s)

3 討 論

卵巢是雌性動物的主性器官，可產(chǎn)生和排出卵子，分泌雌激素和孕激素，卵泡是卵巢的基本功能單位，由卵母細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞組成，其中顆粒細(xì)胞作為卵巢中必需的體細(xì)胞，它可以支持和營養(yǎng)卵母細(xì)胞，并參與卵泡的發(fā)育和多種激素的分泌。研究顯示，卵泡閉鎖與顆粒細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[10-11]。

目前，分析雷公藤甲素對卵巢顆粒細(xì)胞損傷作用的相關(guān)文獻中，其實驗方法多數(shù)是利用卵巢顆粒細(xì)胞進行體外培養(yǎng)后，再使用雷公藤甲素等藥物直接對顆粒細(xì)胞進行刺激干預(yù)，觀察細(xì)胞增殖率或抑制率的變化[12-14]。而本研究則通過雷公藤甲素灌胃造模后再提取分離原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，觀察雷公藤甲素在動物體內(nèi)對卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的作用，避免直接使用藥物單體刺激細(xì)胞時因藥物的理化性質(zhì)帶來的干擾，更真實地反映雷公藤甲素在體內(nèi)的藥物效應(yīng)。

本研究首先根據(jù)雷公藤多苷的人體常用劑量，并結(jié)合相關(guān)文獻[15-17]，根據(jù)大鼠與人的表面積換算公式進行換算，估算了雷公藤甲素的干預(yù)量為50 μg/(kg·d)。結(jié)果顯示，雷公藤甲素干預(yù)后的大鼠卵巢體積變小，結(jié)構(gòu)破壞，閉鎖卵泡明顯增多，成熟卵泡數(shù)量減少，顆粒細(xì)胞的活力也較下降，提示雷公藤甲素對雌性大鼠卵巢有明顯的損傷作用。而在此基礎(chǔ)上選用淫羊藿苷聯(lián)合三七總皂苷來干預(yù)雷公藤甲素誘導(dǎo)的卵巢損傷，發(fā)現(xiàn)治療組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)較模型組有所改善，閉鎖卵泡減少，顆粒細(xì)胞活力較模型組有所提高，提示淫羊藿苷聯(lián)合三七總皂苷對雷公藤甲素誘導(dǎo)的雌性大鼠卵巢功能損傷具有一定的改善作用。

綜上所述，雷公藤甲素可誘導(dǎo)雌性大鼠卵巢發(fā)生損傷，而淫羊藿苷聯(lián)合三七總皂苷可以一定程度上拮抗雷公藤甲素所致的這一損傷作用，這或可為臨床合理應(yīng)用中藥配伍，以減輕雷公藤甲素毒性提供更確切的實驗依據(jù)。但淫羊藿聯(lián)合三七總皂苷的具體作用機制有待進一步深入研究。