楊 哲 胡 雪 吳庚香

(1 武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：1395210785@qq.com；2 湖北省十堰市太和醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰市 442000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是女性常見的內(nèi)分泌和代謝異常疾病[1]，影響著5%～20%的育齡婦女以及絕經(jīng)前婦女[2]，然而其病因以及發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。研究表明，PCOS患者體內(nèi)存在不同程度的氧化與抗氧化失衡[3-4]。槲皮素是膳食中最豐富的類黃酮之一。近年來有研究顯示槲皮素具有出色的抗氧化性能，包括抑制氧化呼吸鏈的擴(kuò)散和清除自由基[5]。本研究應(yīng)用槲皮素對(duì)PCOS大鼠進(jìn)行干預(yù)并觀察大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平的變化，探討槲皮素是否可改善PCOS大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 21日齡未成年雌性SD大鼠30只(體重80～90 g)，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(鄂)2015-0027]。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組、PCOS組以及PCOS+槲皮素組，每組10只，各組大鼠分籠編號(hào)喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及藥物 睪酮、雌激素、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司(批號(hào)：E-EL-0072c、CSB-E05110r、CSB-E06869r、CSB-E12654r)；一氧化氮、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛ELISA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)：A013-2、A014-2、A003-1、A001-1)；脫氫表雄酮購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司(批號(hào)：D106380)；槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：Q4951)。

1.3 動(dòng)物模型的構(gòu)建及標(biāo)本的獲取 參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)[6]，構(gòu)建SD大鼠PCOS動(dòng)物模型，方法如下：所有大鼠均于21日齡斷乳，進(jìn)食普通飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d。自23日齡起，于每日同一時(shí)間，給予PCOS組以及PCOS+槲皮素組大鼠頸部皮下注射脫氫表雄酮，劑量為6 mg/100 g(脫氫表雄酮用0.2 mL橄欖油溶解)，正常對(duì)照組大鼠每日給予頸部皮下注射等量橄欖油，3組均持續(xù)注射20 d。末次給藥后，于次日早8：00，給予PCOS+槲皮素組大鼠灌胃槲皮素100 mg/kg(槲皮素溶于2 mL羧甲基纖維素溶液)，間隔4 h再次給予同樣劑量藥物，PCOS組及正常對(duì)照組灌胃等量不含槲皮素的羥甲基纖維素。第2日晨所有大鼠吸入異氟烷麻醉后，下腔靜脈采血10 mL，經(jīng)3 000 r/min，離心10 min后取上清，分裝保存于-80℃冰箱。取卵巢組織，并經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，鏡下觀察組織的病理變化。

1.4 血清性激素水平的測(cè)定 按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清睪酮、雌激素、FSH、LH水平。主要步驟如下：使用緩沖液稀釋抗體后加入酶標(biāo)板，4℃下保存過夜進(jìn)行包被，次日每孔加入封閉液進(jìn)行洗滌，添加稀釋后的待檢樣品于包被完成的酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，同時(shí)做空白孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔。添加完成后封板并置于37℃暖箱中孵育1～2 h。孵育完成后各孔加入生物素化抗體工作液，37℃孵育1 h，洗滌后加酶結(jié)合物工作液于37℃避光孵育30 min，再加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺底物于37℃避光反應(yīng)10～30 min，最后加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司，型號(hào)：HH3400)上于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。

1.5 血清氧化應(yīng)激相關(guān)分子水平的測(cè)定 根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書的步驟檢測(cè)一氧化氮、NOS、SOD、丙二醛水平。方法基本同上述ELISA的步驟，并設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，不符合正態(tài)分布的資料以[M(P25,P75)]表示,符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(多重比較采用LSD-t檢驗(yàn))，否則組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠的卵巢組織學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠卵巢體積正常，鏡下可觀察到正常的各級(jí)卵泡及黃體。PCOS組及PCOS+槲皮素組大鼠卵巢表面均較蒼白，體積較正常對(duì)照組大，有較多囊狀卵泡，兩組組織病理學(xué)無明顯差異；鏡下見兩組卵巢內(nèi)存在較多擴(kuò)張卵泡，呈現(xiàn)出多囊樣改變，顆粒細(xì)胞層變薄，卵泡膜細(xì)胞增生，卵泡內(nèi)未見放射冠以及卵母細(xì)胞，黃體少見。見圖1。

圖1 3組大鼠卵巢組織鏡下觀(HE染色，×100)

2.2 3組大鼠血清性激素水平的比較 與正常對(duì)照組相比，PCOS組和PCOS+槲皮素組的血清睪酮水平升高(P<0.05)，但PCOS組與PCOS+槲皮素組的血清睪酮水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組間雌二醇、FSH、LH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清性激素水平的比較

2.3 3組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)濃度的比較 與正常對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清SOD濃度降低，丙二醛濃度升高(P<0.05),一氧化氮及NOS濃度雖有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；PCOS+槲皮素組以上指標(biāo)與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與PCOS組相比，PCOS+槲皮素組的血清SOD濃度升高，一氧化氮、丙二醛濃度降低(均P<0.05)，而NOS濃度亦有輕度下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

3 討 論

PCOS患者的卵巢體積增大、外膜增厚，鏡下可觀察到不成熟狀態(tài)下囊性擴(kuò)張的卵泡，并且大多數(shù)患者伴有雄激素水平的增高。本研究采用脫氫表雄酮誘導(dǎo)的PCOS大鼠不管是卵巢的病理組織改變還是激素水平的變化都與PCOS患者高度相似，與既往文獻(xiàn)報(bào)告的結(jié)果[1]相似。

研究表明，氧化應(yīng)激可能參與PCOS發(fā)病的病理生理過程[7]。Murri等[4]的Meta分析結(jié)果表明，PCOS女性體內(nèi)的氧化應(yīng)激循環(huán)標(biāo)志物異常，且與體重超重?zé)o關(guān)。SOD是抗氧化酶系的重要組成部分，具有抗氧化作用；丙二醛是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的終產(chǎn)物，能夠反映細(xì)胞膜受氧化應(yīng)激損傷的程度；一氧化氮是一種活性氮，通過參與傳遞電子參與機(jī)體的氧化還原過程。本研究結(jié)果顯示，PCOS大鼠血清SOD濃度降低，丙二醛濃度升高(P<0.05)，同時(shí)一氧化氮及NOS水平有升高趨勢(shì)，與既往研究結(jié)果[8]相似，這提示PCOS大鼠體內(nèi)存在異常的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

槲皮素是一種被廣泛研究的類黃酮物質(zhì)，在植物性食品中使用最為廣泛。槲皮素以其在自由基清除和抗過敏特性方面的抗氧化活性而著稱[5]。既往研究已經(jīng)證實(shí)，槲皮素可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)谷胱甘肽的含量、氧化應(yīng)激相關(guān)酶的活性及氧化應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)通路來發(fā)揮抗氧化活性[9]。槲皮素因其顯著的抗氧化能力已經(jīng)在肝臟疾病、心血管系統(tǒng)疾病、惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化、神經(jīng)元變性等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。還有研究表明，槲皮素能夠通過抑制還原型輔酶Ⅱ的活性，來平衡活性氧水平并提高抗氧化活性，從而逆轉(zhuǎn)PCOS大鼠血清SOD以及丙二醛等血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的水平[10]。本研究中，PCOS大鼠經(jīng)槲皮素處理后SOD濃度較PCOS組升高，一氧化氮、丙二醛濃度降低(P<0.05)，而NOS濃度亦有輕度下降，且上述氧化應(yīng)激指標(biāo)與正常對(duì)照組接近，說明槲皮素可較好地改善PCOS大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

然而，本研究中經(jīng)槲皮素治療的PCOS大鼠其卵巢形態(tài)及血清雄激素水平均較PCOS組無明顯改變，這可能與給藥時(shí)間較短有關(guān)。有研究顯示，經(jīng)槲皮素100 mg/kg持續(xù)治療28 d后，PCOS大鼠卵巢形態(tài)、卵泡形成以及卵泡囊性擴(kuò)張程度相對(duì)于未處理的PCOS大鼠有所改善[10]；Jahan等[11]報(bào)告用槲皮素30 mg/kg持續(xù)治療22 d后，PCOS大鼠卵巢直徑以及囊性卵泡直徑顯著縮小，且睪酮及LH水平降低。本研究中槲皮素的使用劑量是100 mg/kg，但兩次給藥只間隔4 h，用藥時(shí)間較短，但是即使是在如此短時(shí)間內(nèi)給藥，槲皮素仍能使PCOS大鼠血清FSH的水平較正常對(duì)照組水平有所升高，LH濃度有所下降。因此，槲皮素在改變PCOS大鼠異常的性激素水平方面顯示了較好的潛能，適當(dāng)延長(zhǎng)槲皮素的給藥時(shí)間，其對(duì)性激素、卵巢形態(tài)以及氧化應(yīng)激狀態(tài)的改善效果可能更為顯著[12-13]。

綜上所述，PCOS大鼠存在異常的氧化應(yīng)激狀態(tài)，給予槲皮素干預(yù)能較好地改善PCOS大鼠的氧化應(yīng)激水平，但對(duì)卵巢的形態(tài)和性激素水平的影響不明顯，適當(dāng)延長(zhǎng)槲皮素的給藥時(shí)間可能具有更好的效果。