張東姣 趙彥煥 樊麗偉 汪景坤 李 洵 付曉霞 張 磊 趙玉紅

(中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫(yī)院消化內(nèi)科，河北省保定市 071000，電子郵箱：it300u@163.com)

目前，結(jié)直腸癌發(fā)病率位居全球第三，死亡率位居全球第二，其對人類生活健康造成嚴重威脅[1]。由于起病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)結(jié)直腸癌患者確診時已經(jīng)處于中晚期，有50%～60%患者的腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此預后不理想[2-3]。當前，臨床上主要采用以手術(shù)切除為主、術(shù)后放療和化療為輔的綜合手段治療結(jié)直腸癌[4-5]，雖然其可使得部分患者在提高5年生存率上獲益，但是復發(fā)、耐藥性等問題導致這一綜合手段的治療效果不甚理想，因此尋找安全有效的治療方法迫在眉睫。蔓荊子是馬鞭草科植物蔓荊的成熟干燥果實，具有清利頭目、疏散風熱等功效，常用于治療風熱感冒、頭昏頭痛、耳鳴等癥狀[6]。蔓荊子黃素又稱為紫花牡荊素，是蔓荊子黃酮類化合物的有效成分之一，具有抗炎、抗菌和抗腫瘤等藥理活性[7]。許剛等[8]發(fā)現(xiàn)，蔓荊子黃素可以明顯抑制p53突變型肺癌細胞的增殖，但是其對結(jié)直腸癌細胞的作用及作用機制尚不清楚。泛素樣修飾物激活酶2(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 2，UBA2)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，研究表明UBA2在結(jié)直腸癌組織中高表達，UBA2高表達與晚期結(jié)直腸癌和不良預后有關(guān)，而下調(diào)UBA2表達可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖，并促進細胞凋亡[9]。本研究以體外培養(yǎng)的人結(jié)直腸癌細胞SW480為研究對象，探討蔓荊子黃素對結(jié)直腸癌細增殖、周期和凋亡的影響，以及其作用機制是否與UBA2有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 結(jié)直腸癌細胞SW480購于中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、杜氏改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購于美國Gibco公司(批號分別為10270-106、A4192101)；蔓荊子黃素購于南京植佰萃生物公司(批號：479-91-4)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑盒購買于美國Invitrogen公司(批號分別為11614、10196035)；陰性對照小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、UBA2 siRNA、空載質(zhì)粒載體vector和UBA2過表達質(zhì)粒載體購于廣州銳博生物公司；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒、細胞周期試劑盒、膜聯(lián)蛋白-V(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染試劑盒購于碧云天生物公司(批號分別為ST316、C1052、C1051M)；蛋白裂解液購于北京百奧萊博科技(批號：HR0273-SJL)；二喹啉甲酸購于北京索萊寶(批號：PC0015)；UBA2抗體、p21抗體、c-myc抗體、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購于美國Abcam公司(批號分別為ab185932、ab109310、ab32053、ab32115、ab32428、ab8199)；兔抗人IgG抗體二抗購于北京百奧萊博科技有限公司(批號：F020158-ZRY)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購買于購自日本TaKaRa公司(批號分別為RR026A、DRR380A)；引物購于上海吉瑪公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 將SW480細胞復蘇后，置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，然后加入胰酶消化，細胞融合至85%時進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SW480細胞制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×105個/mL，接種至24孔板內(nèi)，待細胞生長密度至75%時，每孔內(nèi)加入不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的蔓荊子黃素，在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，作為不同濃度的蔓荊子黃素組。其中，將0 μmol/L和40 μmol/L蔓荊子黃素作為對照組和蔓荊子黃素組，用于檢測UBA2 的mRNA和蛋白表達。

另取對數(shù)期生長期的SW480細胞，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將陰性對照siRNA、UBA2 siRNA轉(zhuǎn)染至SW480細胞內(nèi)，6 h后更換培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記為si-NC組、si-UBA2組；將空載質(zhì)粒載體和UBA2過表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染SW480細胞6 h后，加入40 μmol/L蔓荊子黃素處理24 h，分別記為蔓荊子黃素+vector組和蔓荊子黃素+UBA2組。

1.3 MTT法檢測細胞活力 取各組SW480細胞制備細胞懸液，調(diào)整細胞濃度(5×104個/mL)后以100 μL/孔接種至96孔板內(nèi)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后，每孔依次加入10 μL的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，除去培養(yǎng)液，再加入150 μL的二甲基亞砜，待結(jié)晶完全溶解后，應(yīng)用Varioskan LUX 多功能酶標儀(Thermo Fisher公司)檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值。實驗設(shè)置3個復孔，重復3次。計算細胞活力，細胞活力=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡 (1)細胞周期：取相應(yīng)組別SW480細胞，按照3×105個/孔的細胞密度接種于6孔板內(nèi)，在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行消化、離心(12 000 r/min、15 min)，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗細胞，采用預冷70 %乙醇溶液4℃固定過夜。磷酸緩沖鹽溶液清洗2遍，每孔加入10 μL的1 μg/L RNA酶孵育30 min，然后加入10 μL的1 mg/L PI溶液，混勻避光反應(yīng)，使用Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher公司)檢測細胞周期情況。(2)細胞凋亡：取相應(yīng)組別SW480細胞，以每孔3×105個接種于6孔板內(nèi)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后12 000 r/min離心15 min，加入結(jié)合緩沖液重懸細胞。然后按照Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，混勻，避光反應(yīng)15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測UBA2、p21、c-myc、Bax、Bcl-2蛋白表達 取相應(yīng)組別SW480細胞，加入蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，加入二喹啉甲酸檢測蛋白濃度，高溫變性后，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣處理后，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移在聚偏氟乙烯膜上。脫脂奶粉封閉培養(yǎng)2 h，4℃下加入一抗蛋白(稀釋比例為1 ∶600)，孵育過夜，室溫下加入二抗孵育(稀釋比例為1 ∶2000)，加電化學發(fā)光顯色劑顯影、曝光。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參分析目的蛋白相對表達水平。實驗設(shè)置3個復孔，重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR檢測UBA2 mRNA的表達 取相應(yīng)組別SW480細胞，參照TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA模板，然后以GAPDH為內(nèi)參，進行PCR擴增，反應(yīng)體系包括10 μL SYBR-Green，正、反引物各1 μL，2.0 μL cDNA和無菌蒸餾水6.0μL；反應(yīng)條件為95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個循環(huán)。然后按照2-ΔΔCt法計算得出UBA2 mRNA的相對表達水平。UBA2正向引物：5′-TGGACCGCCATGAGCATGAA-3′，反向引物：5′-AGCCTGGAACAAGGCTTTATTTGT-3′；β-肌動蛋白(β-actin)正向引物：5′-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3′，反向引物：5′-TAGGAATCCTTCTGACCCATGCC-3′。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的蔓荊子黃素對SW480細胞增殖和細胞周期的影響 與0 μmol/L組相比，其他組的細胞活力、S期細胞比例和c-myc蛋白表達均降低，G0/G1期細胞比例和p21蛋白表達均增加(均P<0.05)。10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組的細胞活力、S期細胞比例和c-myc蛋白表達均依次降低，G0/G1期細胞比例和p21蛋白表達均依次增加(均P<0.05)。蔓荊子黃素作用細胞48 h，對細胞生長的半數(shù)抑制濃度為35.7 μmol/L。見表1和圖1。

表1 不同濃度蔓荊子黃素組細胞活力、細胞周期及其相關(guān)蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖1 不同濃度蔓荊子黃素對SW480細胞周期的影響

2.2 不同濃度的蔓荊子黃素對SW480細胞凋亡的影響 與0 μmol/L組相比，其他組的細胞凋亡率和Bax蛋白相對表達水平均增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)；10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組的細胞凋亡率和Bax蛋白相對表達水平依次增加，Bcl-2蛋白相對表達水平依次降低(均P<0.05)。見表2和圖2。40 μmol/L的蔓荊子黃素作用效果最佳，結(jié)合半數(shù)抑制濃度，故選擇蔓荊子黃素濃度為40 μmol/L進行后續(xù)實驗。

表2 不同濃度蔓荊子黃素組細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖2 不同濃度蔓荊子黃素對SW480細胞凋亡的影響

2.3 蔓荊子黃素對SW480細胞中UBA2表達的影響 與對照組相比，蔓荊子黃素組的UBA2 mRNA和蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)，見表3和圖3。

表3 兩組SW480細胞中UBA2 mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖3 兩組SW480細胞中UBA2蛋白的表達

2.4 抑制UBA2對SW480細胞增殖和細胞周期的影響 si-UBA2組的UBA2蛋白相對表達水平低于si-NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。與si-NC組相比，si-UBA2組的細胞活力、S期細胞比例和c-myc蛋白相對表達水平降低(P<0.05)，G0/G1期細胞比例和p21蛋白相對表達水平增加(均P<0.05)。見表4和圖4。

表4 抑制UBA2后SW480細胞的活力、細胞周期及相關(guān)蛋白相對表達水平(x±s)

圖4 抑制UBA2對SW480細胞周期和UBA2蛋白表達的影響

2.5 抑制UBA2對SW480細胞凋亡的影響 與si-NC組相比，si-UBA2組的細胞凋亡率、Bax蛋白相對表達水平增加，Bcl-2蛋白相對表達水平降低(均P<0.05)。見表5和圖5。

表5 抑制UBA2后SW480細胞的凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白相對表達水平(x±s)

圖5 抑制UBA2對SW480細胞凋亡的影響

2.6 蔓荊子黃素可能通過調(diào)控UBA2對SW480細胞增殖、凋亡和周期的影響 與蔓荊子黃素+vector組相比，蔓荊子黃素+UBA2組的UBA2蛋白相對表達水平、細胞活力、S期細胞比例、c-myc蛋白和Bcl-2蛋白相對表達水平增加，而G0/G1期細胞比例、p21蛋白相對表達水平、細胞凋亡率和Bax蛋白相對表達水平降低(均P<0.05)。見表6、表7和圖6。

表6 兩組SW480細胞的活力、細胞周期及相關(guān)蛋白相對表達水平(x±s)

表7 兩組SW480細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖6 兩組SW480細胞的增殖、凋亡、周期及相關(guān)蛋白的表達情況

3 討 論

結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率逐年升高，其發(fā)病機制較為復雜，受家族遺傳、環(huán)境和飲食方式等因素的影響[9-10]。蔓荊子是中國傳統(tǒng)的天然醫(yī)藥，含有豐富的化學成分，如黃酮類、萜類、甾體類、蒽醌類等，其抗腫瘤效果明顯，而蔓荊子黃素是黃酮類化合物的成分之一，是抗腫瘤的有效活性成分[11]。研究顯示，蔓荊子黃素通過下調(diào)β-連環(huán)蛋白的表達，抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[12]；并可通過c-Jun氨基端激酶信號通路抑制食管癌細胞的增殖，并誘導其細胞凋亡[13]；其還可以抑制垂體瘤細胞的增殖和誘導其細胞凋亡[14]；此外，其可以通過下調(diào)周期蛋白依賴性激酶1、c-myc和survivin蛋白表達，抑制非小細胞肺癌的增殖和促進其凋亡，阻滯細胞周期[15]。p21是近年發(fā)現(xiàn)的與細胞周期有關(guān)的蛋白抑制基因，對細胞生長有重要作用；而c-myc是一種多功能調(diào)節(jié)基因，可使細胞進行無限增殖，促進細胞增殖及分化[16-17]。因此本研究選擇p21和c-myc作為細胞周期相關(guān)蛋白進行檢測。結(jié)果提示，蔓荊子黃素可降低SW480細胞的活力、S期細胞比例，增加細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例，上調(diào)p21、Bax蛋白表達，并下調(diào)c-myc、Bcl-2蛋白表達，這說明蔓荊子黃素能抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和誘導其凋亡，并阻滯細胞周期，具有明顯的抗腫瘤作用。

小泛素樣修飾因子1(small ubiquitin-like modifier 1,SUMO)蛋白家族是廣泛存在于真核生物的一類高度保守因子，而UBA2是SUMO激活酶的關(guān)鍵因子，在腫瘤細胞中異常表達進而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。UBA2位于人19號染色體q13.11上，在胃癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等均有表達，與腫瘤的臨床特征和不良預后顯著相關(guān)[17]。有研究表明，UBA2在非小細胞肺癌組織中過表達，其異常表達與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，敲除UBA2可以明顯抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，阻滯細胞周期，并誘導其細胞凋亡[18]。同時，UBA2在乳腺癌細胞中也呈高表達，莫能菌素通過下調(diào)UBA2的表達抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進其細胞凋亡[19]。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，下調(diào)UBA2的表達可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[20]；敲除UBA2可通過上調(diào)p53和p21蛋白的表達從而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖并誘導其細胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)蔓荊子黃素干預后，SW480細胞中的UBA2 mRNA和蛋白表達均下調(diào)，由此我們推測UBA2的表達可能與蔓荊子黃素對SW480細胞增殖、周期和凋亡的影響有關(guān)。因此，我們進一步將si-UBA2轉(zhuǎn)染至SW480細胞，發(fā)現(xiàn)與si-NC組相比，si-UBA2組的細胞活力、S期細胞比例、c-myc蛋白和Bcl-2蛋白相對表達水平降低(P<0.05)，細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例、p21蛋白和Bax蛋白相對表達水平增加(均P<0.05)，這表明抑制UBA2表達可以明顯抑制結(jié)直腸癌細胞SW480的增殖，并促進其細胞凋亡，使細胞周期阻滯，這與上述研究結(jié)果相似。隨后，我們再將過表達UBA2的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染SW480細胞以上調(diào)細胞中的UBA2表達，再給予蔓荊子黃素處理，發(fā)現(xiàn)SW480細胞活力、S期細胞比例增加，細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例降低，p21、Bax蛋白相對表達水平下調(diào)，c-myc、Bcl-2蛋白相對表達水平上調(diào)，這說明蔓荊子黃素可能通過調(diào)控UBA2表達發(fā)揮在結(jié)直腸癌細胞中的抗腫瘤作用。

綜上所述，蔓荊子黃素可能通過下調(diào)UBA2表達，抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖，使細胞周期阻滯，并誘導其細胞凋亡。本研究中，未設(shè)立不加蔓荊子黃素、未進行轉(zhuǎn)染處理的空白對照組，以及不加蔓荊子黃素但是轉(zhuǎn)染了UBA2過表達質(zhì)粒載體的SW480細胞組，因此所得結(jié)論仍需進一步實驗加以證實。蔓荊子黃素為結(jié)直腸癌的干預研究提供了新的方向，但是目前的研究只局限于體外實驗，體內(nèi)實驗研究相對較少，需要深入研究以探討其應(yīng)用價值。