楊務(wù)彬

（十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 十堰 442000）

地膚子源自藜科植物地膚Kochia scoparia（L.）Schrad. 的干燥成熟果實(shí)，藥用資源豐富，用于治療皮膚瘙癢、眼睛和泌尿道疾病等[1]。地膚子主要含有三萜皂苷類[2]、揮發(fā)油[3]、黃酮類[4-5]及多糖類[6]等成分。其中皂苷類具有降血糖[7]、抗癌[8]、抗過敏[9]以及抗菌[10]等多種活性。

地膚子總皂苷是其主要活性部位，多采用大孔樹脂富集純化[11]，但對(duì)地膚子總皂苷提取工藝優(yōu)化報(bào)道較少。本研究以地膚子總皂苷得率為指標(biāo)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化地膚子皂苷的超聲提取工藝，并對(duì)地膚子總皂苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，為地膚子總皂苷的分離純化及降糖作用研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；BP211D 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ-300DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

地膚子藥材購自十堰市太和醫(yī)院藥房，經(jīng)十堰市太和醫(yī)院葉方副教授鑒定為藜科植物地膚Kochia scoparia（L.）Schrad. 的干燥成熟果實(shí)。地膚子皂苷Ic 對(duì)照品（批號(hào)：111723-201904，純度≥98%），購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；香草醛（批號(hào)：20170310），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿卡波糖 （批號(hào)：C12067892）、α-葡萄糖苷酶（批號(hào)：12091896）、對(duì)硝基苯-α- D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（批號(hào)：C12101893），均購自上海麥克林生化科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取地膚子皂苷對(duì)照品3.6 mg，用70%乙醇定容至10 mL 容量瓶中，得到濃度0.36 mg/mL 的對(duì)照品貯備液。分別移取對(duì)照品貯備液適量，制成不同濃度的對(duì)照品溶液。

2.2 地膚子樣品溶液的制備

取地膚子藥材粉成碎粉，過80 目篩。準(zhǔn)確稱取粉末2 g，添加乙醇溶液適量，超聲提取，濾過，合并濾液。取一定量的濾液，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容至25 mL，即得。

2.3 總皂苷的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[12]的方法，進(jìn)行總皂苷的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。結(jié)果表明，回歸方程：Y= 1.31X+ 0.167（R2 = 0.999 3）， 表 示 地 膚 子 皂 苷 在0.036 ～0.216 mg/mL 內(nèi)具備較好的線性關(guān)系。

2.4 地膚子總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

配制碳酸鈉溶液、阿卡波糖溶液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液、α-葡萄糖苷酶溶液以及PNPG 溶液，將最優(yōu)條件下提取的地膚子總皂苷提取液，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋成濃度在0 ～ 3.5 mg/mL 的樣品溶液，以阿卡波糖做對(duì)照，并將阿卡波糖稀釋成與樣品濃度一致的溶液。分別制成樣品測(cè)定組（加樣品溶液與α-葡萄糖苷酶溶液）、樣品空白組（不加α-葡萄糖苷酶溶液）、陽性對(duì)照組（加阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶溶液）以及陽性空白組（阿卡波糖溶液），參照鄭麗婷等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。抑制率計(jì)算公式為：

式中：A1為陽性對(duì)照組，A2陽性空白組，A3樣品測(cè)定組，A4樣品空白組。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 單因素試驗(yàn)及結(jié)果分析

2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)地膚子總皂苷得率的影響按“2.2”項(xiàng)下的方法，準(zhǔn)確稱取地膚子藥材7份，各2 g。固定超聲提取時(shí)間：30 min，液料比：40 mL/g，選用體積分?jǐn)?shù)分別是30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，進(jìn)行地膚子樣品溶液的制備及測(cè)定，并計(jì)算總皂苷得率，見圖1。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，地膚子總皂苷得率最高；超過70%時(shí)，溶劑極性降低，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生失水，通透性降低，導(dǎo)致地膚子總皂苷得率下降。因此，選擇70%乙醇作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)地膚子總皂苷得率的影響（n = 6）Fig. 1 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different ethanol concentration（n = 6）

2.6.2 超聲時(shí)間對(duì)地膚子總皂苷得率的影響 按“2.2”項(xiàng)下的方法，準(zhǔn)確稱取地膚子藥材6 份，各2 g。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為40 mL/g，分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，進(jìn)行地膚子樣品溶液的制備及測(cè)定，并計(jì)算總皂苷得率，結(jié)果見圖2。提取時(shí)間增加，地膚子總皂苷的得率升高，提取時(shí)間為30 min 時(shí)，地膚子總皂苷的得率最大；超聲時(shí)間過長，可能導(dǎo)致部分皂苷成分降解；且雜質(zhì)溶出增多，黏度提高，傳質(zhì)過程減慢，降低了地膚子總皂苷的得率。因而選擇超聲提取時(shí)間30 min 作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)地膚子總皂苷得率的影響（n = 6）Fig. 2 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different extraction time（n = 6）

2.6.3 液料比對(duì)地膚子總皂苷得率的影響 按“2.2”項(xiàng)下的方法，準(zhǔn)確稱取地膚子藥材6 份，各2 g。乙醇體積分?jǐn)?shù)：70%，超聲提取時(shí)間：30 min，以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 （mL/g）的液料比，進(jìn)行地膚子樣品溶液的制備及測(cè)定，并計(jì)算總皂苷得率，結(jié)果見圖3。當(dāng)液料比為40 mL/g時(shí)，地膚子總皂苷得率最高。這可能是由于液料比較低時(shí)，皂苷不能完全溶解于溶劑，導(dǎo)致總皂苷得率不高；但液料比過大時(shí)，溶劑的傳質(zhì)阻力增大，導(dǎo)致總皂苷得率下降。因而選擇40 mL/g 的液料比作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

圖3 液料比對(duì)地膚子總皂苷得率的影響（n = 6）Fig. 3 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different liquid-solid ratio （n = 6）

2.7 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化地膚子總皂苷提取工藝及結(jié)果分析

2.7.1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比為考察因素，地膚子總皂苷得率為指標(biāo)，利用Box–Behnken設(shè)計(jì)，優(yōu)化地膚子總皂苷的提取工藝。因素及水平見表1，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)的因素水平表Tab. 1 The factors and levels of experiment

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n = 3）Tab. 2 Design and results（n = 3）

2.7.2 回歸模型的建立及數(shù)據(jù)分析 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=7.596 + 0.261 25A+ 0.253 75B+ 0.265C+ 0.197 5AB–0.31AC– 0.04BC– 0.951 75A2- 0.441 75B2- 0.269 25C2（R2= 0.981 7，R2Adj= 0.958 1），表明該模型準(zhǔn)確性較高，可用于地膚子總皂苷提取得率的預(yù)測(cè)分析。

方差分析見表3，回歸模型的P= 0.000 1 < 0.01，說明所建立的回歸方程模型非常顯著；失擬項(xiàng)P=0.642 1 ＞0.05，表明該試驗(yàn)選擇的因素合理。乙醇體積分?jǐn)?shù)（P= 0.001 2 < 0.01）、提取時(shí)間（P= 0.001 4 <0.01）以及液料比（P= 0.001 1 < 0.01）對(duì)地膚子總皂苷得率有影響。其中，AB（P= 0.026 9 < 0.05），AC（P= 0.003 2 < 0.01）、A2（P= 0.000 1 < 0.01）、B2（P= 0.000 4 < 0.01）、C2（P= 0.005 9 < 0.01）。

表3 回歸模型的方差分析Tab. 3 Analysis of variance of regression model

2.7.3 響應(yīng)面分析 各條件對(duì)地膚子總皂苷得率影響的相互作用，見圖4。乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用曲面陡峭，說明二者的相互作用對(duì)地膚子總皂苷得率的影響顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用的曲面較陡峭，說明二者的交互作用對(duì)地膚子總皂苷得率的影響十分明顯；而提取時(shí)間與液料比交互作用的曲面平緩，說明二者的交互作用對(duì)地膚子總皂苷得率的影響不顯著。交互作用的分析結(jié)果與回歸分析的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明所建立的模型較合適。

2.7.4 提取工藝的驗(yàn)證 按照已建立的回歸模型，預(yù)測(cè)地膚子總皂苷的最優(yōu)提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.027%，提取時(shí)間為32.916 min，液料比為44.015 mL/g， 此條件下地膚子總皂苷的預(yù)測(cè)得率為7.70%。為便于實(shí)驗(yàn)操作，微調(diào)后提取工藝參數(shù)是：乙醇體積分?jǐn)?shù)為71%，提取時(shí)間為33 min，液料比為44 mL/g。按照優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行三次超聲提取，得到地膚子總皂苷的得率分別為7.51%、8.01%和7.56%，平均得率為（7.69 ± 0.28）%，與預(yù)測(cè)值較為接近。

2.8 地膚子總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

地膚子總皂苷提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制情況見圖5。地膚子總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用存在濃度依賴性，當(dāng)?shù)啬w子總皂苷提取液濃度在0.1 ～ 3.0 mg/mL 時(shí)，隨著濃度的增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率活性逐漸增強(qiáng)；濃度在3.0 ～3.5 mg/mL，抑制率基本不變。表明地膚子總皂苷具備α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖 4 影響地膚子總皂苷得率的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface to total saponins value in Kochia scoparia seeds

圖5 地膚子總皂苷提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響（n = 3）Fig. 5 α-Glucosidase inhibitory activity of total saponins solvents of Kochia scoparia seeds（n = 3）

3 討論

預(yù)試驗(yàn)考察了回流提取、索氏提取以及超聲提取對(duì)地膚子總皂苷得率的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，回流提取地膚子總皂苷得率較低，可能與回流提取溫度高，導(dǎo)致皂苷類成分的分解有關(guān)。索氏提取時(shí)，總皂苷得率稍低于超聲提取，且索氏提取不便于工業(yè)化生產(chǎn)，故地膚子總皂苷的提取方法選為超聲提取。

單因素實(shí)驗(yàn)考查了乙醇體積分?jǐn)?shù)（30% ～90%）、超聲時(shí)間（10 ～ 60 min）、液料比（10 ∶1 ～60 ∶1 mL/g）對(duì)地膚子總皂苷得率的影響，在考查范圍內(nèi)，地膚子總皂苷得率存在先增加后減少的現(xiàn)象。優(yōu)化的地膚子總皂苷最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為71 %，提取時(shí)間為33 min，液料比為44 mL/g。在此工藝下，地膚子總皂苷的得率為（7.69 ± 0.28）%，優(yōu)于夏玉鳳等[14]提取得到的地膚子總皂苷5.76%，表明超聲提取具備一定的可行性。

4 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法與單因素相結(jié)合對(duì)地膚子總皂苷超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，所確定的工藝穩(wěn)定、節(jié)約溶劑、能耗較低，是潛在的工業(yè)化提取新方法。體外α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)顯示，最優(yōu)條件下得到的地膚子總皂苷提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性。但本試驗(yàn)只進(jìn)行了地膚子總皂苷提取液的體外抑制α-葡萄糖苷酶實(shí)驗(yàn)，后續(xù)還需要進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步純化，并進(jìn)行藥效活性成分追蹤，明確具體成分，為地膚子制劑的開發(fā)及臨床合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。