王孟杰 樓喬明 張 茹 黃 濤 張進(jìn)杰 楊文鴿

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，寧波 315800)

DHA(docosahexaenoic acid，C22∶6n-3)，又名二十二碳六烯酸，是一種重要的n-3型長鏈多不飽和脂肪酸，其能有效促進(jìn)嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)和智力發(fā)育，調(diào)節(jié)血脂，預(yù)防心血管疾病，以及提高免疫力，增強(qiáng)抗炎和抗癌等多種重要生理功能[1，2]。目前，DHA作為重要的新型功能性保健因子，已廣泛應(yīng)用于食品、保健品以及醫(yī)藥等行業(yè)[3-5]。

隨著功能性油脂行業(yè)的發(fā)展，DHA的生產(chǎn)方式也已從傳統(tǒng)深海魚油提取轉(zhuǎn)向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵生產(chǎn)。裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)，別名裂壺藻，是真菌門的一類單細(xì)胞海洋微生物，被認(rèn)為是理想的DHA新生資源[6，7]。2010年國家衛(wèi)生部將裂殖壺菌油脂列為新資源食品，其可替代魚油，作為功能性油脂用于嬰幼兒配方奶粉和多不飽和脂肪酸營養(yǎng)強(qiáng)化劑[8,9]。

目前，裂殖壺菌日益成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，并在菌種選育培養(yǎng)和營養(yǎng)方面已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，但在其脂質(zhì)成分及抗氧化活性方面卻鮮有報(bào)道。因此以裂殖壺菌干粉為原料，采用Folch法對其油脂進(jìn)行提取，并通過氣相色譜-質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)分別對其脂肪酸組成和脂質(zhì)成分進(jìn)行分析，同時(shí)對油脂的自由基清除能力和總抗氧化能力進(jìn)行測定，以期為裂殖壺菌油脂成分分析、營養(yǎng)評價(jià)和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂殖壺菌干粉、氘代氯仿(CDCl3，氘代度99.8%+0.03%TMS)、水楊酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、TPTZ(三吡啶三吖嗪)和菲啰嗪等。

1.2 儀器與設(shè)備

RV-10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 7890B型氣相色譜儀和5977A型質(zhì)譜儀， AVANCE Ⅲ 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀， SpectraMax i3型多功能酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油脂提取[10]

采用Folch法對裂殖壺菌干粉油脂進(jìn)行提取。稱取10 g裂殖壺菌干粉，加入200 mL三氯甲烷-甲醇混合液(2∶1)，超聲30 min，并浸提24 h；過濾后，濾液用50 mL 0.9%氯化鈉溶液振蕩洗滌，倒入分液漏斗中靜置分層；收集下層三氯甲烷，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后，得到裂殖壺菌油脂。

1.3.2 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg油脂，加入1 mL 5% H2SO4-CH3OH溶液，70 ℃水浴1 h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，依次加入1 mL正己烷和0.5 mL蒸餾水，振蕩混勻后靜置分層，取上清液，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，用于GC-MS分析。

色譜條件：HP-INNOWax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度140 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持15 min；進(jìn)樣量1.0 μL，分流比20∶1；以氦氣為載氣，載氣流量1 mL/min，溶劑延遲時(shí)間3 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250 ℃，EI離子源，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍：m/z50～500 u。

1.3.3 核磁共振分析

取50 mg裂殖壺菌油脂，用0.6 mL氘代氯仿溶解，并轉(zhuǎn)移至核磁管中用于核磁共振分析。采用標(biāo)準(zhǔn)的一維氫譜脈沖程序采集氫譜，氫去耦的碳譜脈沖程序采集碳譜。氫譜采集參數(shù)：探針溫度293.4 K，光譜儀頻率400.13 MHz，掃描次數(shù)16，空掃次數(shù)2，采集點(diǎn)數(shù)65 536，氫譜寬度8 012.82 Hz。碳譜采集參數(shù)：探針溫度294.0 K，光譜儀頻率100.62 MHz，掃描次數(shù)50，空掃次數(shù)4，采集點(diǎn)數(shù)65 536，碳譜寬度24 038.46 Hz。

1.3.4 抗氧化能力測定

裂殖壺菌油脂經(jīng)無水乙醇超聲溶解，依次配制成質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50 mg/mL的溶液。DPPH自由基清除能力參照楊娜等[11]方法測定，羥基自由基清除能力參照李巨秀等[12]方法測定，ABTS+自由基清除能力參照楊皓彬等[13]方法測定，總抗氧化能力(FRAP法)參照Ting等[14]方法測定，并以維生素C為對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除氣相色譜-質(zhì)譜和核磁共振外，其他各項(xiàng)指標(biāo)均平行測定3次；通過SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法(ANOVE)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用Duncan法進(jìn)行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸分析

裂殖壺菌油脂經(jīng)甲酯化衍生后，采用GC-MS對其脂肪酸進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖見圖1，其脂肪酸分析鑒定結(jié)果列于表1。從表1可知，裂殖壺菌油脂脂肪酸組成簡單，以C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(DPA，13.66%)和C22:6n-3(DHA，42.04%)為主，且多不飽和脂肪酸含量(PUFA，58.94%)遠(yuǎn)高于飽和脂肪酸(SFA，41.06 %)。C22∶6n-3，俗稱“腦黃金”，是目前已知的碳鏈最長的n-3型多不飽和脂肪酸，在嬰幼兒視網(wǎng)膜形成、神經(jīng)發(fā)育和智力提高等方面起著關(guān)鍵作用；同時(shí)其亦具有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫活力以及參與炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)抗炎和抗癌能力等多種生理功能[15，16]。裂殖壺菌油脂富含C22∶6n-3，脂肪酸組成簡單，且與C22∶6n-3具有拮抗作用的結(jié)構(gòu)類似脂肪酸C20∶5n-3含量較低(1.81%)，便于C22∶6n-3的工業(yè)化分離制備，因此裂殖壺菌油脂具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，尤其是嬰幼兒食品方面的具有巨大開發(fā)潛力。

圖1 裂殖壺菌油脂脂肪酸組成的總離子流色譜圖

表1 裂殖壺菌油脂的脂肪酸組成

2.2 核磁共振分析

2.2.1 氫譜分析

裂殖壺菌油脂的核磁共振氫譜(1H-NMR)如圖2所示，其譜峰歸屬列于表2。從核磁共振氫譜可以區(qū)分來自飽和脂肪酸(SFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的信號，且氫譜的譜峰積分與濃度直接成正比，可用以分析不同脂肪酸的比例[17]。從核磁共振氫譜可見，0.85～0.89譜峰為除n-3型多不飽和脂肪酸之外的其他脂肪酸末端甲基上的氫，0.95～0.98為n-3型多不飽和脂肪酸末端甲基上的氫，兩者譜峰積分比可計(jì)算出n-3型多不飽和脂肪酸酸的含量。2.28～2.35和2.37～2.43譜峰分別歸屬為飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸(C22∶6n-3和C22∶5n-6)2位上的氫；2.76～2.88譜峰為多不飽和脂肪酸雙鍵間亞甲基上的氫；4.13～4.17和4.28～4.32譜峰為甘油骨架中亞甲基上的氫；5.26～5.29譜峰為甘油骨架中次甲基上的氫；5.31～5.40譜峰歸屬為所有不飽和脂肪酸碳碳雙鍵上的氫。同時(shí)，從核磁共振氫譜中未見磷脂酰膽堿(PC)中與氮原子相連的甲基((CH3)3N—)上的氫(3.33)，以及磷脂酰乙醇胺(PE)中與氮原子相連的亞甲基(—CH2N)上的氫(3.79)[18]。從核磁共振氫譜可知裂殖壺菌油脂富含n-3型多不飽和脂肪酸，且油脂以甘油三酯為主，不含磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺等磷脂成分。

圖2 裂殖壺菌油脂的核磁共振氫譜圖

表2 裂殖壺菌油脂的核磁共振氫譜譜峰歸屬

2.2.2 碳譜分析

裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜(13C-NMR)如圖3所示，其譜峰歸屬列于表3。碳譜分辨率高，譜峰重疊程度低，致使裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜比氫譜出峰多且復(fù)雜[19]。從核磁共振碳譜中可觀察到5個(gè)譜區(qū)：甲基譜區(qū)(11～15)、亞甲基譜區(qū)(20～40)、甘油譜區(qū)(50～75)、烯烴譜區(qū)(121～141)和羰基譜區(qū)(172～180)[18，20]。

圖3 裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜圖

表3 裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜譜峰歸屬

續(xù)表3

在甲基譜區(qū)(11～15)，n-6型多不飽和脂肪酸(主要為C22∶5n-6)、飽和脂肪酸(主要為C16∶0和C14∶0)以及n-3型多不飽和脂肪酸(主要為C22∶6n-3) 中甲基譜峰的化學(xué)位移分別14.08、14.12和14.27，譜峰區(qū)分明確；同時(shí)通過譜峰積分比較，可直接證明裂殖壺菌油脂中的二十二碳五烯酸(DPA)為n-6型多不飽和脂肪酸(C22∶5n-6)，而非n-3型多不飽和脂肪酸(C22∶5n-3)，這與氣相色譜-質(zhì)譜定性結(jié)果一致，亦與Zhu和Ashford等學(xué)者的脂肪酸定性分析結(jié)果一致[21，22]。在甘油譜區(qū)(50～75)，61.99～62.16和68.88～69.00分別歸屬為甘油三酯中甘油骨架上sn-1,3和sn-2位碳原子。在羰基譜區(qū)(172～178)，172.04譜峰歸屬為結(jié)合于甘油三酯sn-2位上C22∶6n-3和C22∶5n-6的羰基碳原子，172.42譜峰歸屬為結(jié)合于甘油三酯sn-1,3位上C22∶6n-3和C22∶5n-6的羰基碳原子；172.75～172.95譜峰歸屬為除C22∶6n-3和C22∶5n-6外所有結(jié)合于甘油三酯sn-2位上脂肪酸的羰基碳原子，173.14譜峰歸屬為除C22∶6n-3和C22∶5n-6外所有結(jié)合于甘油三酯sn-1,3位上脂肪酸的羰基碳原子，而178.57譜峰歸屬為游離脂肪酸的羰基碳原子，因此可根據(jù)碳譜中羰基碳原子的化學(xué)位移快速鑒定甘油骨架上sn-1,3位和sn-2位上結(jié)合的脂肪酸類型[17]。從核磁共振碳譜可知裂殖壺菌油脂以甘油三酯為主，含有少量的游離脂肪酸；且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不飽和脂肪酸主要結(jié)合于甘油三酯的sn-2位，這與齊冬梅等[5]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)所得的C22∶6n-3和C22∶5n-6分布趨勢一致。

2.3 自由基清除能力

自由基易與細(xì)胞膜磷脂中多不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵發(fā)生反應(yīng)造成細(xì)胞膜破壞，并進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷，是加速人體衰老和誘發(fā)某些疾病的重要原因之一[23]。裂殖壺菌油脂對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基(·OH)的清除能力見圖4。從圖4可知，裂殖壺菌油脂質(zhì)量濃度在10～50 mg/mL范圍內(nèi)，其對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基均具有一定清除能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，自由基清除率顯著增加(P<0.05)，并呈現(xiàn)典型的量效關(guān)系；當(dāng)裂殖壺菌油脂質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，對三種自由基的清除率分別達(dá)到77.81%、67.44%、56.19%；同時(shí)通過擬合計(jì)算得到裂殖壺菌油脂對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的半清除率(IC50值)分別為32.16、36.21、40.58 mg/mL，均高于維生素C，表明裂殖壺菌油脂具有較好的自由基清除能力，但清除能力均弱于維生素C。

圖4 裂殖壺菌油脂的自由基清除率

2.4 總抗氧化能力

FRAP法是抗氧化物在酸性條件下還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生藍(lán)紫色Fe2+-TPTZ，通?？寡趸飳e3+-TPTZ的還原能力與抗氧化能力成正相關(guān)，在593 nm處測定Fe2+-TPTZ即可獲得抗氧化物的總抗氧化能力[24，25]。FRAP法作為總抗氧化能力的評價(jià)指標(biāo)已廣泛應(yīng)用于食品和保健品的抗氧化能力分析?？偪寡趸芰y定標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。由圖5可知，在0～0.6 mmol/L范圍內(nèi)，F(xiàn)eSO4濃度與其在593 nm處吸光值成良好線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.827 7x-0.018 9(R2=0.997 6)，表明以593 nm處吸光值換算成裂殖壺菌油脂的FeSO4當(dāng)量濃度的方法是可行的[13]。

裂殖壺菌油脂的總抗氧化能力結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，裂殖壺菌油脂具有一定的抗氧化能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，其總抗氧化能力顯著增加(P<0.05)，且增加趨勢呈線性關(guān)系，線性回歸方程：y=0.011 9x-0.032 3(R2=0.991 6)，表明方程的擬合度較好。當(dāng)裂殖壺菌油脂的質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，其總抗氧化能力達(dá)到0.57 mmol/L，但遠(yuǎn)低于維生素C，表明裂殖壺菌油脂具有較好的總抗氧化能力，且呈顯著量效關(guān)系，但弱于同等質(zhì)量濃度的維生素C。

圖5 總抗氧化測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 裂殖壺菌油脂的總抗氧化能力

3 結(jié)論

裂殖壺菌油脂的脂肪酸以C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(13.66)和C22∶6n-3(42.04%)為主；其油脂成分以甘油三酯為主，含有少量游離脂肪酸，但不含磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿等磷脂成分，且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不飽和脂肪酸主要結(jié)合于甘油三酯的sn-2位。同時(shí)，裂殖壺菌油脂具有較好的DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的清除能力和總抗氧化能力，且在10～50 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系(P<0.05)。裂殖壺菌油脂富含C22∶6n-3以及較好的抗氧化能力，表明裂殖壺菌油脂具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可作為C22∶6n-3的重要生物來源，在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。