梁惲紅，盧 涵，張香美

（河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061）

魚體經(jīng)去頭、去內(nèi)臟、采肉、漂洗、脫水、斬拌等工藝可制成魚糜（Surimi），斬拌后魚糜加入食鹽等調(diào)味料擂潰成黏稠魚肉糊后再加熱，成為彈性凝膠體，即魚糜凝膠。魚糜凝膠中最主要的蛋白質(zhì)是肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein,MP），對(duì)凝膠形成貢獻(xiàn)最大，因此肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)魚糜凝膠形成和品質(zhì)具有重要影響[1]。

肌原纖維蛋白是一種鹽溶性蛋白，需在離子強(qiáng)度＞0.5的中性鹽溶液中溶解，主要由肌球蛋白（Myosin）、肌動(dòng)蛋白（Actin）、原肌球蛋白（Tropomyosin）及肌鈣蛋白（Troponin）構(gòu)成，肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)是維持魚肉肌肉及相關(guān)制品質(zhì)構(gòu)及持水力重要原因[2]。肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽主鏈骨架原子空間相對(duì)盤繞、折疊，主要形式包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲，氫鍵是維持蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力；肌原纖維蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)是二級(jí)結(jié)構(gòu)通過側(cè)鏈基團(tuán)借助次級(jí)鍵維系進(jìn)一步卷曲、折疊所形成的特定空間構(gòu)象，主要是疏水相互作用、氫鍵、離子鍵、二硫鍵共同作用[3]，如圖1所示。魚糜凝膠形成與α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開和聚集密切相關(guān)，因魚糜凝膠是肌原纖維蛋白在氫鍵、疏水相互作用、離子鍵、二硫鍵共同作用下相互交聯(lián)聚集形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作用力變化影響魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力。

圖1 蛋白質(zhì)分子間作用力[3]Fig.1 Intermolecular forces of proteins

在魚糜加工制作及運(yùn)輸貯藏過程中，除去魚肉自身酶作用[4]，肌原纖維蛋白不可避免受外部環(huán)境（如溫度、壓力、pH、環(huán)境中氧氣、斬拌速度等）影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，而肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化在很大程度上影響魚糜凝膠品質(zhì)。質(zhì)構(gòu)和持水力是評(píng)定魚糜凝膠品質(zhì)兩個(gè)重要指標(biāo)。質(zhì)構(gòu)特性體現(xiàn)魚糜制品新鮮度和魚糜凝膠內(nèi)部特性細(xì)微變化，表現(xiàn)為硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性、回彈性和黏附性等參數(shù)；持水力指蛋白質(zhì)凝膠保持水分能力，受凝膠微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和水之間相互作用等因素影響[5]。另外，根據(jù)凝膠強(qiáng)度與硬度相似性，凝膠強(qiáng)度也可用于反映魚糜凝膠品質(zhì)[6]。Andersen等報(bào)道，當(dāng)肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，造成肌原纖維蛋白無序聚集，使形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)孔隙不均、大小不一，破壞魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)與持水力[7]。儀淑敏等試驗(yàn)結(jié)果表明，高壓破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，重新締結(jié)成具有均勻網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的蛋白凝膠體，同時(shí)更多自由水與蛋白質(zhì)形成結(jié)合水，增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度和持水性能[8]。但肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)及持水力的影響機(jī)制尚不清楚。

本文從蛋白分子間作用力角度出發(fā)，從氫鍵、疏水相互作用、離子鍵及二硫鍵等方面闡述肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)及持水力影響，并簡(jiǎn)要介紹比較魚糜凝膠蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，如圖2所示，揭示肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)及持水力影響機(jī)制，為改進(jìn)魚糜及魚糜制品品質(zhì)，選擇更適合的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法提供理論參考。

圖2 文章結(jié)構(gòu)內(nèi)容示意Fig.2 Structure and content of paper

1 氫鍵對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力的影響

1.1 氫鍵與魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力關(guān)系

氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力，也是魚糜凝膠有較好硬度和持水力原因之一。劉芳芳等認(rèn)為，氫鍵在蛋白質(zhì)受熱變性時(shí)發(fā)生斷裂，魚糜凝膠冷卻后重新形成，起穩(wěn)定結(jié)合水、提高凝膠硬度的作用[9]。Wang等發(fā)現(xiàn)氫鍵含量顯著升高時(shí)，凝膠保水性也顯著增加[10]。張小燕等研究顯示，氫鍵含量增加時(shí)凝膠強(qiáng)度也增加，對(duì)維持凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有積極作用[11]。因此，蛋白中氫鍵含量越高，對(duì)維持魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)、持水力越有利。

1.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)與魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力的關(guān)系

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲4種形式，不同形式間可互相轉(zhuǎn)化，其作用力主要由氫鍵維持。不同形式二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力影響有所不同。α-螺旋結(jié)構(gòu)主要通過氨基酸C=O和N-H形成分子內(nèi)氫鍵維持，如圖3a所示。研究表明，α-螺旋是天然蛋白質(zhì)中二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)象，在魚糜加工制成魚糜凝膠時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)部分解螺旋轉(zhuǎn)化成β-折疊、β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)則卷曲[12]。β-折疊是有序平面結(jié)構(gòu)，分為平行式和反平行式兩種，主要通過氨基酸分子之間形成的氫鍵維持，如圖3b所示。β-轉(zhuǎn)角表現(xiàn)為回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲是指無一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，通過氫鍵維持其構(gòu)象[3]。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相較于α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)更無序[13]，α-螺旋向有序的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化更有利于形成規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡(luò)，使魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力較好，而α-螺旋向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力較差[14]。Wang等研究顯示，β-折疊含量最高時(shí)，凝膠具有更均勻的微觀結(jié)構(gòu)，凝膠強(qiáng)度與持水力也更大[10]。Zhang等提出高溫下形成的魚糜凝膠無規(guī)則卷曲含量最高，肌原纖維蛋白分子無序聚集，降低蛋白質(zhì)間交聯(lián)程度，從而凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不均勻、粗糙、孔大，降低魚糜產(chǎn)品凝膠強(qiáng)度[15]。因此，肌原纖維蛋白分子中氫鍵更多表現(xiàn)為α-螺旋或β-折疊時(shí)，對(duì)維持魚糜或魚糜凝膠結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力有利。

圖3 α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)[3]Fig.3α-helix andβ-sheet structure

1.3 氫鍵及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.1 氫鍵測(cè)定

拉曼光譜在830 cm-1和850 cm-1處峰值變化比值（I850/I830）可用于判斷酪氨酸殘基包埋程度及體系氫鍵含量，I850/I830值為0.9～1.45表示酪氨酸酚羥基基團(tuán)與水分子形成氫鍵，比值為0.7～1.0表示與蛋白質(zhì)中其他基團(tuán)形成氫鍵[16]。Zhang等測(cè)得當(dāng)壓力為0.1～200 MPa時(shí)，比值為0.965～1.029，表明酪氨酸殘基暴露，并與水分子形成氫鍵，此時(shí)凝膠持水力較高；當(dāng)壓力大于300 MPa時(shí)，比值下降到0.705，表明酪氨酸中酚羥基與蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生氫鍵，有助于凝膠結(jié)構(gòu)形成及凝膠強(qiáng)度增加[17]。

1.3.2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲4種形式，其中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)對(duì)魚糜凝膠形成貢獻(xiàn)最高。目前，科研人員普遍采用圓二色譜、拉曼光譜以及傅里葉變換紅外光譜技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，表1概括介紹3種方法。圓二色譜與波長(zhǎng)有關(guān)，α-螺旋圓二色譜峰處于208～222 nm，β-折疊、無規(guī)則卷曲色譜峰為190～206 nm[18]。Cao和Xiong采用圓二色譜法檢測(cè)到氧化后肌原纖維蛋白在220 nm處螺旋發(fā)生顯著衰減，表明肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)朝無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，使肌原纖維蛋白無規(guī)則聚集，對(duì)凝膠形成不利[19]。

表1 氫鍵蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法總結(jié)Table 1 Summary of hydrogen bond and protein secondary structure determination methods

拉曼光譜通常用于表征二級(jí)結(jié)構(gòu)的是酰胺Ⅰ區(qū)，區(qū)域范圍1 600～1 700 cm-1，具體各表征不同二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域隨選用測(cè)定儀器不同有細(xì)微差別[20]。Jia等采用拉曼光譜測(cè)定肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)凝膠特性的影響，結(jié)果顯示，α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-折疊結(jié)構(gòu)增加，表示α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)化，凝膠強(qiáng)度較高[21]。

在傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）中，大多通過酰胺I區(qū)（1 600～1 700 cm-1）光譜變化分析二級(jí)結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部氫鍵結(jié)合情況[22]。趙冰等利用FT-IR法測(cè)定氧化對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與凝膠關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)α-螺旋和β-折疊部分遭到破壞，轉(zhuǎn)化成不規(guī)則β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由穩(wěn)定向不穩(wěn)定轉(zhuǎn)變，進(jìn)而造成凝膠結(jié)構(gòu)松散，無法形成致密穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度和持水力[23]。

1.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法比較

圓二色譜、拉曼光譜與傅里葉變換紅外光譜對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果一致，即α-螺旋大部分轉(zhuǎn)化成β-折疊，形成的凝膠具有較好硬度與持水力，當(dāng)α-螺旋和β-折疊氫鍵斷裂，形成較多β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲時(shí)，凝膠硬度和持水力較差。但需注意的是，這3種方法各有利弊，詳見表2。

表2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法比較Table 2 Comparison of protein secondary structure determination methods

2 疏水相互作用對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力的影響

2.1 疏水相互作用與凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力的關(guān)系

疏水相互作用作為維持凝膠結(jié)構(gòu)另一主要非共價(jià)作用力，由肌原纖維蛋白側(cè)鏈基團(tuán)上某些特定疏水氨基酸殘基暴露于極性環(huán)境形成[24]。Du等研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白中部分掩蓋疏水氨基酸殘基隨三級(jí)結(jié)構(gòu)展開而暴露，隨后由于蛋白質(zhì)重新聚合，暴露的疏水氨基酸殘基又重新進(jìn)入肌原纖維蛋白內(nèi)部，疏水相互作用呈先增后降趨勢(shì)[25]。

適當(dāng)?shù)氖杷鶊F(tuán)暴露在極性環(huán)境中有利于蛋白質(zhì)重新聚集，蛋白質(zhì)重排形成孔隙均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠具有較好質(zhì)構(gòu)和持水力[26]，如圖4a～b所示，適當(dāng)增加微波加熱頻率（300～500 W）使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，更多疏水基團(tuán)暴露，增強(qiáng)蛋白質(zhì)間相互作用，使其重新聚集形成更均勻凝膠網(wǎng)絡(luò)[27]。Yu等研究不同鍵斷裂劑對(duì)魚糜凝膠特性和蛋白構(gòu)象的影響，結(jié)果顯示，在鍵斷裂劑SDS濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開，疏水側(cè)鏈暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，凝膠硬度和凝膠彈性增加[28]。Li等研究結(jié)果表明，疏水相互作用形成和二硫鍵增強(qiáng)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此更多的水分子可固定于凝膠結(jié)構(gòu)，凝膠持水力增強(qiáng)[29]。而過度疏水基團(tuán)暴露在極性環(huán)境中預(yù)示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)過度展開，使形成凝膠所必需的交聯(lián)被破壞，也不利于水分子保留于凝膠，導(dǎo)致凝膠的質(zhì)構(gòu)和持水力較差，如圖4c所示，當(dāng)微波加熱頻率從500 W升至800 W時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，無法有序重新聚集，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不均勻，孔隙粗大且無序[27]。Chen等通過向肌原纖維蛋白中添加疏水基團(tuán)，證實(shí)引入過多疏水基團(tuán)時(shí)，蛋白質(zhì)分子間形成凝膠所必需的交聯(lián)可能被破壞，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)劣化，凝膠硬度和彈性均降低[30]。薛思雯等研究報(bào)道，過多暴露包埋的疏水基團(tuán)可能對(duì)凝膠持水力起反作用，可能是因?yàn)榧≡w維蛋白分子過度展開而難以再形成致密凝膠網(wǎng)絡(luò)，不利于水分子包埋于凝膠網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致凝膠持水力下降[31]。

圖4 不同微波加熱頻率下肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)[27]Fig.4 Microstructure of myofibrillar protein gel under different microwave heating power（SEM）

2.2 疏水相互作用測(cè)定

通常采用熒光光譜法和拉曼光譜法檢測(cè)魚糜凝膠中疏水相互作用的變化。其中內(nèi)源熒光光譜法是通過檢測(cè)色氨酸熒光強(qiáng)度變化，表征蛋白質(zhì)內(nèi)部極性環(huán)境變化[32]。Wei等研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)暴露色氨酸殘基，使疏水相互作用增加，內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，肌原纖維蛋白凝膠形成均勻致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這預(yù)示肌原纖維蛋白疏水相互作用增強(qiáng)蛋白質(zhì)間的相互作用，凝膠微觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較好，具有良好彈性和持水力[27]。

另外，疏水殘基可與熒光探針結(jié)合，產(chǎn)生熒光效應(yīng)。根據(jù)這一原理，可采用外源熒光光譜法加入熒光探針檢測(cè)肌原纖維蛋白中疏水性殘基。用于作為熒光探針的有8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、溴酚藍(lán)[19]等。Xiao等采用ANS作為熒光探針檢測(cè)不同位置鱷魚肉中肌原纖維蛋白表面疏水性，結(jié)果顯示，尾部較肢體和腿部肌原纖維蛋白暴露的疏水基團(tuán)更多，表面疏水性更強(qiáng)，因此尾部肌原纖維蛋白更易聚集，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更均勻致密，形成的凝膠強(qiáng)度及持水力顯著高于其他部位[33]。

芳香族氨基酸側(cè)鏈如色氨酸具有拉曼光譜特征吸收峰，可采用拉曼光譜法表征疏水基團(tuán)變化情況。760 cm-1處特征峰歸因于色氨酸殘基環(huán)振動(dòng)，當(dāng)疏水微環(huán)境中掩埋的色氨酸殘基暴露于極性環(huán)境時(shí)，760 cm-1附近峰強(qiáng)度可能減少[34]。Wang等采用拉曼光譜測(cè)得肌原纖維蛋白凝膠中疏水相互作用變化，并表示色氨酸嵌入疏水環(huán)境中可能形成有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)，有利于保持持水力[16]。這也表示過多疏水基團(tuán)暴露可能不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)和凝膠形成較好持水力。

2.3 疏水相互作用測(cè)定方法比較

將內(nèi)源熒光光譜、外源熒光光譜、拉曼光譜3種方法作比較，具體如表3所示。

表3 疏水相互作用測(cè)定方法比較Table 3 Comparison of hydrophobic interaction determination methods

3 離子鍵對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力的影響

3.1 離子鍵與凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力關(guān)系

在魚糜正常pH下，肽鏈上谷氨酸和天冬氨酸羧基基團(tuán)帶負(fù)電，而賴氨酸和精氨酸氨基基團(tuán)帶正電，這些基團(tuán)間形成離子鍵，又稱為鹽橋。離子鍵有助于維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，其形成加強(qiáng)蛋白質(zhì)間交聯(lián)，通常在維持凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力方面起輔助增強(qiáng)作用[35]。在肌原纖維蛋白形成魚糜凝膠過程中，通常添加氯化鈉以破壞蛋白質(zhì)間離子鍵，使蛋白質(zhì)解離，蛋白質(zhì)解離對(duì)于熱凝膠彈性結(jié)構(gòu)形成是必需的，解離后蛋白質(zhì)又通過蛋白質(zhì)間離子鍵、蛋白質(zhì)與氯化鈉之間離子鍵共同作用增強(qiáng)魚糜凝膠強(qiáng)度[36]。

魚糜正常pH下肌原纖維蛋白凈電荷呈負(fù)電性，陽離子可通過形成蛋白質(zhì)-陽離子-蛋白質(zhì)橋加速蛋白質(zhì)間相互作用，從而提高凝膠硬度和持水力，如圖5所示。勵(lì)建榮等研究表明帶正二價(jià)的鈣離子在相鄰蛋白質(zhì)之間結(jié)合負(fù)電基團(tuán)可形成離子鍵，有助于增加魚糜凝膠強(qiáng)度[36]。Arfat和Benjakul研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+也可與蛋白質(zhì)負(fù)電荷結(jié)構(gòu)域之間形成鹽橋，而后蛋白質(zhì)通過鹽橋交聯(lián)，改善蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)[37]。Wang等也表示，當(dāng)肌原纖維蛋白凝膠中離子鍵含量達(dá)到最大時(shí)，凝膠具有最高含水率，原因可能是隨靜電相互作用增加，凝膠持水力提高[10]。

圖5 陽離子在蛋白質(zhì)間作用過程Fig.5 Interaction process of cations between proteins

3.2 Zeta電位測(cè)定離子鍵

離子鍵可采用Zeta電位變化表示。具有高Zeta電位（絕對(duì)值）蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定，而具有低Zeta電位蛋白質(zhì)傾向于凝聚或絮凝[38]。從目前研究結(jié)果看，較高Zeta電位絕對(duì)值可能增加蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但Zeta電位值過高是否對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性造成不利影響還有待于進(jìn)一步探究。Zhang等測(cè)定在不同壓力下Zeta電位變化，結(jié)果顯示，隨壓力增加（0.1～200 MPa），肌原纖維蛋白加熱成膠時(shí)，Zeta電位絕對(duì)值逐漸升高，蛋白質(zhì)開始聚集成大分子聚合物，隨后蛋白質(zhì)聚合物之間空間變大，具有更多負(fù)電荷，有助于吸引水分子；形成的凝膠由均勻小孔洞組成，有利于提高凝膠強(qiáng)度，且水分子被牢牢鎖在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，使其具有更高硬度和較好持水力[17]。楊玉玲等通過研究氧化對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力影響發(fā)現(xiàn)，隨氧化程度增加，Zeta電位逐漸降低，預(yù)示離子鍵作用降低，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)孔徑變大、膠束不均現(xiàn)象，進(jìn)而影響凝膠超微結(jié)構(gòu)和凝膠彈性[39]。

4 二硫鍵對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力的影響

4.1 二硫鍵與凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力關(guān)系

二硫鍵形成被認(rèn)為和巰基（-SH）變化高度相關(guān)，凝膠強(qiáng)度隨巰基含量增加而降低，巰基含量越低，凝膠強(qiáng)度越大，巰基含量減少主要由于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開，位于肌原纖維蛋白內(nèi)部的巰基暴露，游離的巰基受氧化作用形成二硫鍵[40]。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開使巰基暴露，這與疏水相互作用形成過程中疏水基團(tuán)暴露過程相似，且?guī)€基氧化形成二硫鍵又加強(qiáng)蛋白質(zhì)之間交聯(lián)，說明二硫鍵形成有助于凝膠強(qiáng)度增加，二硫鍵對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)形成有重要貢獻(xiàn)[11]。

適量二硫鍵可使魚糜凝膠有較好質(zhì)構(gòu)和持水力，但過量二硫鍵對(duì)魚糜凝膠持水力產(chǎn)生負(fù)面影響。鄭紅等研究表明，二硫鍵含量與鱔魚肉彈性、咀嚼性、回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)特性之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），二硫鍵含量越低，蛋白結(jié)構(gòu)越松散[41]。Chen等表示壓力處理后凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，二硫鍵含量增加可補(bǔ)償這一現(xiàn)象，從而使魚糜凝膠具有良好凝膠性能和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[42]。但過多二硫鍵并不能使魚糜凝膠有良好持水力，因?yàn)榇罅慷蜴I形成阻止肌原纖維蛋白最佳重排，形成的凝膠雖硬度較高但因不均一性和孔徑尺寸增加而導(dǎo)致持水力下降[43]。

4.2 二硫鍵測(cè)定

拉曼譜帶500～550 cm-1處是二硫鍵特征峰，且半胱氨酸巰基拉伸振動(dòng)在2 550～2 580 cm-1區(qū)域產(chǎn)生弱拉曼帶，因此可采用拉曼光譜測(cè)定二硫鍵[16]。Wang等采用拉曼光譜檢測(cè)到位于525 cm-1附近拉曼光譜強(qiáng)度先增后降[44]，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開，使巰基暴露并形成二硫鍵（t-g-g構(gòu)象），隨肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化，二硫鍵又向其他兩種構(gòu)象（t-g-t位于543 cm-1和g-g-g位于510 cm-1）[34]轉(zhuǎn)化，使S-S在525 cm-1處伸縮振動(dòng)減弱。

相較于拉曼光譜，研究人員常用化學(xué)試劑檢測(cè)二硫鍵，這種方法優(yōu)點(diǎn)在于可使二硫鍵形成來源及過程顯示更清楚。二硫鍵發(fā)生在一級(jí)或高級(jí)結(jié)構(gòu)中相鄰半胱氨酸殘基之間，可在非還原條件下用碘乙酰胺（IAM）標(biāo)記蛋白質(zhì)中原有自由半胱氨酸，在加入還原劑打開二硫鍵后，再用N-乙基馬來酰亞胺（NEM）等其他烷基化試劑封閉新產(chǎn)生的自由巰基，通過烷基化標(biāo)簽的質(zhì)量數(shù)差異質(zhì)譜分析其中的二硫鍵[45]。Lin等采用Ellman試劑法檢測(cè)二硫鍵含量[46]，根據(jù)還原二硫鍵前后試劑DTNB與巰基結(jié)合顯色效果，二硫鍵增加使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，提高魚糜凝膠強(qiáng)度。

4.3 二硫鍵測(cè)定方法比較

拉曼光譜可反映蛋白中多個(gè)基團(tuán)變化情況，但也因其包含信息量大，具有一定分析難度。烷基化試劑和Ellman試劑法均是通過將二硫鍵還原成巰基檢測(cè)，常被用于定量分析，同時(shí)可顯示出巰基與二硫鍵變化相關(guān)性，但檢測(cè)步驟較復(fù)雜，有一定操作難度。具體差異如表4所示。

表4 二硫鍵測(cè)定方法比較Table 4 Comparison of disulfide bonds determination methods

5 結(jié)論與展望

綜上，氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化有利于凝膠形成。疏水相互作用、離子鍵、二硫鍵均在蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中起作用。適當(dāng)疏水相互作用及二硫鍵有利于魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)和持水力，但過量疏水相互作用及二硫鍵對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)及持水力帶來不利影響。因而控制魚糜凝膠形成條件（鹽濃度、溫度、壓力、氧化強(qiáng)度等），使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)不被過度破壞，是改善魚糜制品品質(zhì)關(guān)鍵。

通過比較幾種測(cè)定方法發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可應(yīng)用范圍最廣，不僅可測(cè)定蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，還可檢測(cè)一些化學(xué)鍵與基團(tuán)，但其靈敏度和準(zhǔn)確性較其他測(cè)定方法差。因此，結(jié)合實(shí)際情況，選取幾種測(cè)定方法結(jié)合使用可使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確和全面。另外，除文章中所涉及測(cè)定結(jié)構(gòu)方法外，掃描電鏡（SEM）、低場(chǎng)核磁共振（LF-NMR）、凝膠電泳（SDS-PAGE）、蛋白組學(xué)等方法，可共同確定蛋白質(zhì)變化及其對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)及持水力的影響。