張鉉哲，任雪琦，趙 雪，徐浩然，陳蘇慧，周子豪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

我國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，種植面積和產(chǎn)量均較高[1]。黑龍江省因其獨(dú)有冷涼氣候條件及緯度條件適于馬鈴薯生產(chǎn)，為我國馬鈴薯主要種植地區(qū)之一[2]。馬鈴薯晚疫病是影響馬鈴薯產(chǎn)量嚴(yán)重病害之一[3]，危害程度和防治難度較大，是一種爆發(fā)急、可循環(huán)發(fā)生的毀滅性病害[4]。馬鈴薯晚疫病菌群體動態(tài)分析與病害發(fā)生和流行關(guān)系密切，可為馬鈴薯晚疫病防治提供重要理論依據(jù)。因此，馬鈴薯晚疫病菌群體動態(tài)分析成為研究人員關(guān)注重點(diǎn)。簡單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple sequence repeats，SSR），也稱為微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite），將片段擴(kuò)增后產(chǎn)物通過聚丙烯凝膠酰胺電泳分析多態(tài)性。近年來SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳育種、種屬鑒定、遺傳變異等研究領(lǐng)域。Arafa等利用12對引物對采自埃及的40株馬鈴薯晚疫病菌測定SSR基因型，共檢測出SSR基因型有7種[5]。王騰于2010～2013年采集黑龍江省71株馬鈴薯晚疫病菌中發(fā)現(xiàn)，黑龍江地區(qū)菌株遺傳相似系數(shù)范圍有逐年增加趨勢，且親緣關(guān)系與采集地點(diǎn)之間相關(guān)性不明顯[6]。

本研究旨在測定2019～2020年黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌表現(xiàn)型（瑞毒霉敏感性、交配型）和基因型（mtDNA單倍型、SSR基因型）。通過明確黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌表現(xiàn)型和基因型，掌握晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，以期在馬鈴薯生產(chǎn)過程中監(jiān)測晚疫病發(fā)生，并為其有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試馬鈴薯晚疫病菌

2019～2020年，在黑龍江省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)：哈爾濱市[呼蘭區(qū)（HL）、香坊區(qū)（XF）、賓縣（BX）]，齊齊哈爾市[克山縣（KS）、依安縣（YA）]，綏化市[北林區(qū)（BL）、望奎縣（WK）、青岡縣（QG）]，雙鴨山市[寶清縣（BQ）]，雞西市[虎林市（HL）]，牡丹江市[東安區(qū)（DA）]等地區(qū)采集菌株。其中克山縣（KS）23株、依安縣（YA）15株、香坊區(qū)（DN）77株、呼蘭區(qū)（HL）11株、北林區(qū)（SH）18株、望奎縣（WK）9株、東安區(qū)（MDJ）31株，虎林市（HL）25株、賓縣（BX）16株、寶清縣（BQ）21株、青岡縣（QG）16株。

馬鈴薯A1、A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理研究室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

1 L 20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基：800 mL蒸餾水、200 mL番茄汁、20 g瓊脂、4.5 g碳酸鈣。

1 L選擇性培養(yǎng)基：0.5 g氨芐青霉素、0.05 g利福平、0.2 g萬古霉素、0.1 g匹馬霉素、0.035 g五氯硝基苯、0.01 g苯菌靈。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯晚疫病菌交配型測定

1.2.1.1 對峙培養(yǎng)法測定交配型

采用皿內(nèi)對峙法測定交配型。將待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株對峙培養(yǎng)，以待測菌株單獨(dú)培養(yǎng)為對照，置于21℃培養(yǎng)15～21 d后，顯微鏡觀察菌落交界處是否產(chǎn)生卵孢子，如待測菌株僅與A2交配型菌株對峙培養(yǎng)時產(chǎn)生卵孢子,則該菌株為A1交配型；反之，僅與A1交配型菌株對峙培養(yǎng)時產(chǎn)生卵孢子則為A2交配型；如果待測菌株單獨(dú)培養(yǎng)時即產(chǎn)生卵孢子,則為自育型菌株，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.1.2 馬鈴薯晚疫病菌DNA提取

收集在番茄汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～25 d菌絲體于研缽中,加液氮研磨成粉末狀后,采用植物DNA提取試劑盒提取菌絲基因組DNA（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2.1.3 分子標(biāo)記法測定交配型

參考Brylińska等PCR-RFLP方法分析交配型[7]。

1.2.2 馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗藥性測定

通過生長速率法測定晚疫病菌對甲霜靈抗藥性。取直徑為7 mm待測菌株菌餅接種到0、5、10、100 mg·L-1濃度梯度甲霜靈的番茄汁培養(yǎng)基平板上，將其在21℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測定各處理菌落直徑，設(shè)置3次重復(fù)。甲霜靈敏感性劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：敏感菌株（S），含甲霜靈5、100 mg·L-1平板菌落直徑≤40%對照菌落直徑；中抗菌株（MR），含甲霜靈5 mg·L-1平板菌落直徑≥40%對照菌落直徑且100 mg·L-1平板菌落直徑≤40%對照菌落直徑；高抗菌株（HR），含甲霜靈5、100 mg·L-1平板菌落直徑≥40%對照菌落直徑。

1.2.3 馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型測定

1.2.3.1 馬鈴薯晚疫病菌DNA提取

DNA提取同1.2.1.2。

1.2.3.2 線粒體DNA單倍型測定方法

參考Shaw和Griffith[8]的PCR-RFLP方法測定線粒體DNA單倍型，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠檢測，劃分標(biāo)準(zhǔn)參考Griffith等方法可將馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA單倍型劃分為4種類型[8],即Ⅰa、Ⅱa、Ⅰb和Ⅱb型。

1.2.4 馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型測定

1.2.4.1 SSR引物序列及方法

參考Knapova等[9]測定馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型。試驗(yàn)采用11對引物，即Pi4B、Pi4G、G11、Pi63、Pi70、SSR2、SSR3、SSR4、SSR6、SSR8、SSR11。具體引物序列見表1。

表1 SSR基因型測定所用引物序列Table 1 Primer sequence for detection of SSR genotype

參考王晨[10]方法利用以上11對SSR引物擴(kuò)增。

反應(yīng)體系（25μL）：DNA模板0.5μL，F(xiàn)-Primer 1μL，R-Primer 1μL，2×PCR Master Mix 13μL，ddH2O 9.5μL。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，此后35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性35 s，57℃退火40 s，72℃延伸20 s，最終72℃延伸8 min。向4μL PCR樣品中加入2μL的6×Loading Buffer混合，將其置于95℃條件下變性10 min，將變性后樣品經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染，凝膠在燈箱下觀察拍照以供分析。

1.2.4.2 擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶結(jié)果，出現(xiàn)條帶記為1，未出現(xiàn)條帶則記為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣后，使用NTSYSpc（version 2.1）（Exeter Software，Setauket，NY）和Population geneticanalysis1.3.2軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯晚疫病菌交配型、甲霜靈抗性及mtDNA單倍型測定

2.1.1 馬鈴薯晚疫病菌交配型測定

在2019～2020年，于黑龍江省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)采集并分離262個菌株，對所有菌株測定交配型。結(jié)果見表2，A1交配型菌株占81.3%，A2交配型菌株占11.1%，SF型菌株占7.6%，在黑龍江省各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)A1和A2交配型菌株可發(fā)生有性生殖。

表2 2019～2020年馬鈴薯晚疫病菌交配型分析Table 2 Analysis of mating type of Phytophthora infestans from 2019 to 2020

2.1.2 馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗性及mtDNA單倍型測定

結(jié)果見表3。

表3 2019～2020年馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗性及mtDNA單倍型分析Table 3 Analysis of metalaxyl resistance and mtDNA haplotype of potato late blight from 2019 to 2020

在甲霜靈抗性檢測中，55%菌株為高抗性菌株，27.1%菌株為中抗性菌株，17.9%菌株為敏感性菌株。在mtDNA單倍型檢測中，共檢測出兩種線粒體單倍型，其中24株（9.2%）為Ia型，238株（90.8%）為IIa型。

2.2 馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型分析

2.2.1 部分引物PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳檢測

利用11對引物對供試菌株DNA作PCR擴(kuò)增，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，所有擴(kuò)增結(jié)果均檢測到目的條帶且條帶清晰。部分菌株及部分產(chǎn)物檢測結(jié)果如下圖所示（見圖1）。

圖1 部分菌株的部分引物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of some strains with partial primers

2.2.2 SSR聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測及多態(tài)性分析

將經(jīng)11對引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，部分菌株及部分產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖2所示。

圖2 部分菌株聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis of some strains

對262株馬鈴薯晚疫病菌11對引物等位基因和Nei′s基因多樣性分析結(jié)果顯示（見表4），通過比較所有等位基因Nei′s基因多樣性發(fā)現(xiàn)，SSR2的Nei′s基因多樣性為0.4985，比其他等位基因Nei′s基因多樣性均高，說明在所測菌株中，SSR2產(chǎn)生多樣性比其他10對等位基因高。在11對等位基因中，SSR3的Nei′s基因多樣性最低，為0.1262，而11對等位基因平均Nei′s基因多樣性為0.2734。由此可見，SSR3等位基因基因多樣性指數(shù)較低。

表4 馬鈴薯晚疫病菌群體中11對引物等位基因頻率及多樣性Table 4 Frequency and diversity of allele in Phytophthora infestans population identificated by using 11 primer pairs

2.2.3基因型分析

利用11對引物對262株馬鈴薯晚疫病菌標(biāo)記，共檢測出39種基因型，編號為H-1～H-39。在所檢測出的基因型中，優(yōu)勢基因型為H-11，基因型頻率為18.32%，其次為H-28，基因型頻率為13.74%（見表5）。

表5 馬鈴薯晚疫病菌基因型及基因型頻率Table 5 Genotype and genotype frequency of Phytophthora infestans isolates in different location of Heilongjiang Province

從采集年份看，2019年共檢測出28種基因型，2020年共檢測出35種基因型，基因型H-9、H-18、H-26、H-27為2019年所特有基因型，基因型H-29～H-39為2020年所特有基因型。從采集地點(diǎn)看，望奎縣基因型頻率為77.78%，基因型復(fù)雜度最高，哈爾濱市香坊區(qū)基因型頻率為29.87%，基因型復(fù)雜度最低，各市縣基因型存在差異。

2.2.4聚類分析

根據(jù)SSR分析結(jié)果，應(yīng)用R stdio軟件對39個不同基因型馬鈴薯晚疫病菌作UPGMA聚類分析（見圖3～4）。利用11對引物將2019年黑龍江省各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集的137株馬鈴薯晚疫病菌劃分為28個基因型。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.82時，將所測菌株分為3個聚類組，其中第一個聚類組共有40個菌株，占29.2%；第二個聚類組共有35菌株，占25.5%；第三個聚類組共有62個菌株，占45.3%。利用11對引物將2020年采集的125株馬鈴薯晚疫病菌劃分為35個基因型。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.82時，將所測菌株分為3個聚類組，其中第一個聚類組共有68個菌株，占54.4%；第二個聚類組共有56個菌株，占44.8%；第三個聚類組僅有1個菌株，占0.8%。由圖3、4可見，所測菌株被區(qū)分出來的3個聚類組里，每個聚類組所包含菌株采集地點(diǎn)存在區(qū)別，但總體上無明顯劃分趨勢。因此，馬鈴薯晚疫病菌聚類組與采集地點(diǎn)無相關(guān)性。

圖3 2019年黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌聚類圖Fig.3 Dendrogram of Phytophthora infestans in part of Heilongjiang Province in 2019

從采集年份看，2020年所檢測SSR基因型較2019年更復(fù)雜，且2019～2020年均有新基因型出現(xiàn)。因此，黑龍江省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)采集的馬鈴薯晚疫病菌聚類組與采集時間存在相關(guān)性，不同年份間聚類組存在差異。

2.2.5 遺傳多樣性分析

應(yīng)用Population genetic analysis 1.3.2數(shù)據(jù)分析軟件分析262個馬鈴薯晚疫病菌菌株遺傳多樣性，分析結(jié)果見表6。黑龍江省各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)馬鈴薯晚疫病菌群體na（等位基因數(shù)）、ne（有效等位基因數(shù)）、h（基因多樣度）、I（Shannon指數(shù)）如表6所示。

表6 黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性Table 6 Genetic diversity of Phytophthora infestans populations in different regions of Heilongjiang Province

根據(jù)地點(diǎn)劃分后，各項(xiàng)多樣性參數(shù)出現(xiàn)差異。其中，有效等位基因數(shù)、基因多樣度、Shannon指數(shù)以虎林市最高（ne=1.5364；h=0.3094；I=0.4651），望奎縣最低（ne=1.3950；h=0.2288；I=0.3399）。等位基因數(shù)以虎林市最高（na=1.9231），依安縣最低（na=1.6254）。群體多態(tài)性位點(diǎn)為28，多態(tài)性百分比為72.01%，其中虎林市多態(tài)性最高，百分比為92.31%；依安縣多態(tài)性最低，百分比為61.54%。

圖4 2020年黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌聚類圖Fig.4 Dendrogram of Phytophthora infestans in part of Heilongjiang Province in 2020

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對2019～2020年采集自黑龍江省部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)馬鈴薯晚疫病菌開展分離與培養(yǎng)，并測定交配型、甲霜靈抗性和線粒體單倍型。發(fā)現(xiàn)在近兩年中A1交配型菌株呈先增后減趨勢，但在2019～2020年A1交配型菌株占比最高，與沙海天等研究結(jié)果一致[11]，關(guān)于A1交配型菌株優(yōu)勢菌株地位是否發(fā)生變化仍需深入研究。甲霜靈敏感性菌株有逐年增加趨勢，說明黑龍江省各地區(qū)晚疫病菌對甲霜靈抗藥性逐年下降，與孫秀梅等研究結(jié)果相反[12]，可能與近年來黑龍江省減少甲霜靈藥劑使用，其他類型藥劑防治馬鈴薯晚疫病有關(guān)。目前，黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌優(yōu)勢線粒體單倍型為IIa型，同時近年來線粒體單倍型變化情況復(fù)雜，表明晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此關(guān)于馬鈴薯晚疫病菌遺傳變異規(guī)律仍需深入研究。

在國內(nèi)外研究中，通常利用多種不同引物對馬鈴薯晚疫病菌作SSR基因型分析。王佳楠利用29對引物分析黑龍江省采集的103株馬鈴薯晚疫病菌遺傳多樣性，結(jié)果顯示21對引物可表現(xiàn)出多態(tài)性，表明黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌遺傳多樣性較豐富[13]。王鶴利用6對引物測定采自黑龍江省和吉林省SF型馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測SF型菌株中菌株基因型較為單一[14]。姚國勝等在黑龍江省采集的17株馬鈴薯晚疫病菌發(fā)現(xiàn)F-01和G-01兩種基因型，其中F-01占比更高，且其與國外菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[15]。

本試驗(yàn)利用11對引物對2019～2020年采集自黑龍江省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的262株馬鈴薯晚疫病菌作SSR基因型分析，11對引物均表現(xiàn)出多態(tài)性，共鑒定出39種基因型，H-11為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為18.32%。從采集年份上看，2019年共檢測出28種基因型，2020年檢測出35種基因型，基因型H-9、H-18、H-26、H-27為2019年所特有基因型，基因型H-29～H-39為2020年所特有基因型，且在不同年份之間存在差異。從采集地點(diǎn)上看，與其他幾個地區(qū)相比，望奎縣基因型復(fù)雜度最高，在所采集的9個菌株中發(fā)現(xiàn)7種基因型，同年份各個地區(qū)之間基因型分布存在差異，與上述研究結(jié)果一致。研究表明黑龍江省晚疫病菌遺傳多樣性較豐富，與王佳楠等研究結(jié)果一致[13]。綜上所述，馬鈴薯晚疫病表現(xiàn)性和基因型有逐年復(fù)雜化趨勢，可能是有性生殖基因重組所致，具體原因需進(jìn)一步探究。