錢婷婷, 朱旭婷， 盧吟秋， 李依桐， 喻春皓， 謝洪平*

(1．淮陰工學(xué)院制藥工程系，江蘇淮安,223000;2．蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇蘇州,215123;3．江南大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇無(wú)錫，214000)

代謝組學(xué)在肝臟疾病研究中獲得了一定的應(yīng)用，包括診斷、治療和機(jī)制研究[1]。由于中藥及其提取物在肝功能調(diào)節(jié)和肝病治療中具有獨(dú)特療效，因此基于代謝組學(xué)的研究被關(guān)注[2 - 8]，包括復(fù)方中藥對(duì)肝纖維化[2]和肝損傷的干預(yù)[3]、單味中藥對(duì)肝損傷的干預(yù)和保護(hù)[4]、單味中藥提取物對(duì)肝功能的調(diào)節(jié)[5 - 7]和肝損傷的治療[6,8]。在代謝組學(xué)模型中均能夠發(fā)現(xiàn)中藥可以阻止肝功能的失調(diào)和肝損傷治療的回調(diào)，因此，代謝組學(xué)可以用于中藥療效的評(píng)價(jià)。

水飛薊賓(Silybin,SIL)為單味中藥提取物，屬黃酮木脂素類化合物[9]，臨床上常用于急慢性肝炎、肝中毒和肝硬化的治療，同時(shí)它也有肝功能保護(hù)和調(diào)節(jié)作用[7]。對(duì)于代謝組學(xué)的研究，包括基于核磁共振代謝譜的降低脂質(zhì)合成[5]，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)作為代謝譜的肝損傷預(yù)防和治療[6]，以及基于液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)尿液樣本作為代謝譜的肝損傷治療[8]。眾所周知，代謝組學(xué)模型的準(zhǔn)確性主要取決于代謝譜的準(zhǔn)確表達(dá)和多變量分析方法的正確選擇兩個(gè)因素[10,11]。為了讓代謝譜盡可能準(zhǔn)確地表征因藥物毒性導(dǎo)致的偏離正常生理狀態(tài)(穩(wěn)態(tài))，或者因藥物治療導(dǎo)致的回調(diào)至正常生理狀態(tài)，也主要由兩方面的因素決定：第一，檢測(cè)方法能夠讓代謝樣本中的“所有組分”盡可能地出現(xiàn)“選擇性”的檢測(cè)信號(hào)，如大量的分離色譜峰，這是正確表征組分含量變化的前提，正是基于此，LC-MS比GC-MS更為廣泛地應(yīng)用于代謝物檢測(cè)；第二，代謝物譜中包括了內(nèi)源性和外源性代謝物信號(hào)，而內(nèi)源性代謝物譜偏離穩(wěn)態(tài)或者回調(diào)至穩(wěn)態(tài)才是代謝組學(xué)模型的基礎(chǔ)，因此準(zhǔn)確表達(dá)藥物毒性或者藥物治療的代謝譜只能包含內(nèi)源性代謝物信號(hào)和穩(wěn)定的不變信號(hào)。然而，LC-MS檢測(cè)信號(hào)中，必須消除外源性代謝物信號(hào)和色譜基線漂移[10,11]，否則相對(duì)于正常對(duì)照組，模型組所包含的這些差異性信號(hào)將導(dǎo)致模型動(dòng)物組偏離正常組的程度被擴(kuò)大化，即模型組的毒性被放大；在對(duì)模型組動(dòng)物進(jìn)行治療時(shí)，向正常組的回調(diào)程度又會(huì)被弱化，即藥效被弱化，而更多的是表現(xiàn)為“既偏離模型組又偏離正常組”[8]。事實(shí)上，僅僅從模式識(shí)別來(lái)看，當(dāng)預(yù)測(cè)樣本的分類行為與校正樣本不一致時(shí)，表明模式識(shí)別模型是不正確的。當(dāng)然，基于此的代謝組學(xué)模型對(duì)藥物毒性或者藥效的預(yù)測(cè)也就是不可靠的，甚至是錯(cuò)誤的。而中藥的組分含量普遍較低，決定了療效的溫和性以及毒性的不顯著性，代謝組學(xué)模型中的病理或者毒理差異將會(huì)更小，外源性代謝物信號(hào)和色譜基線漂移的影響將更為顯著。

本文擬用LC-MS為檢測(cè)技術(shù)，以尿液為檢測(cè)樣本，利用本課題組建立的外源性代謝物信號(hào)的消除方法[10]和基線漂移校正方法[11]，獲取內(nèi)源性代謝物譜，以此表達(dá)代謝輪廓，建立主成分分析(PCA)代謝組學(xué)模型，擬發(fā)現(xiàn)代謝標(biāo)記物，并以此標(biāo)記物為基礎(chǔ)建立偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)代謝組學(xué)模型。對(duì)水飛薊賓組在治療前和治療后的代謝組學(xué)行為進(jìn)行研究，擬實(shí)現(xiàn)水飛薊賓治療肝損傷療效的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。建立的中藥治療評(píng)價(jià)方法將具有非損傷性、靈敏性、方便性和持續(xù)性的顯著特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(Acquity UPLC)-三重四極桿質(zhì)譜儀(Quattro Premie XE)，美國(guó)Waters公司。低溫高速離心機(jī)(Avanti J-26XP)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。高速離心機(jī)(TGL-16B)，上海安亭科學(xué)儀器公司。

甲醇、乙腈和甲酸購(gòu)自Merck公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與檢測(cè)樣本獲取

取健康雄性SD大鼠15只(清潔級(jí)，體重150±20 g)由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每天置于控制光照12 h、黑暗12 h、室溫25±2 ℃、相對(duì)濕度40%～60%條件下，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，再隨機(jī)分為對(duì)照組(Con組，n=5)、模型組(Mod組，n=5)和水飛薊賓組(Sil組，n=5)，單只動(dòng)物單個(gè)代謝籠飼養(yǎng)。

在0～24 h，模型組和水飛薊賓組，用20%的四氯化碳橄欖油溶液，按2 mL/kg單劑量灌胃[12]；對(duì)照組給予相同體積的橄欖油溶液。24 h后即得肝損傷動(dòng)物模型。在24～48 h，水飛薊賓組按治療劑量100 mg/kg(50 mg/mL水溶液)，分上午和下午2次灌胃給藥；模型組和對(duì)照組給予相同體積的蒸餾水。分別收集每只動(dòng)物在0～24 h和24～48 h的尿液，每只接尿器中加入1.0 mL 1%的疊氮鈉溶液作為防腐劑。

在采血前12 h，實(shí)驗(yàn)大鼠禁食。實(shí)驗(yàn)后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，下腔靜脈采血，在不加抗凝劑的EP管中靜置1 h后，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液即血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于生化指標(biāo)測(cè)定。同時(shí)將大鼠肝臟組織去除邊緣5 mm后，剪切相同部位一小塊，置于10%甲醛溶液的容器中固定24 h以上，送蘇州大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室制作病理切片，待顯微鏡檢測(cè)。

1.3 尿液樣本預(yù)處理與檢測(cè)

預(yù)處理：同一尿液樣本分別取1.4 mL于2只EP管中，在13 000 r/min、4 ℃離心10 min，各取上清液1.0 mL合并入15 mL離心管中，加入6.0 mL的甲醇，渦旋，振搖，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液分裝入1.5 mL EP管中，置-80 ℃冰箱保存待測(cè)。超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)檢測(cè)前，將樣品從-80 ℃冰箱中取出。加體積比1∶1 的甲醇，渦旋混勻后13 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液于13 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶，即刻檢測(cè)。

UPLC-MS檢測(cè)：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm；Waters公司)，柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。梯度程序以流動(dòng)相A表示為：0→1→3→7→11→12→14 min對(duì)應(yīng)為99%A→99%A→85%A→50%A→5%A→99%A→99%A。每10個(gè)樣本間穿插一個(gè)質(zhì)控樣本，以監(jiān)測(cè)儀器的穩(wěn)定性。離子源為電噴霧離子源，正離子模式檢測(cè)；脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h；毛細(xì)管電壓為2 000 V；錐孔電壓為30 V。每0.5 s采集一次譜圖，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 消除色譜基線漂移

代謝譜準(zhǔn)確表達(dá)的首要前提是代謝樣本中各組分的含量變化要盡可能地準(zhǔn)確表達(dá)，這就要求檢測(cè)時(shí)各組分色譜峰要盡可能地分離，為此在選定色譜柱及流動(dòng)相后，采用梯度洗脫，以保證盡可能多地分離出色譜峰，嚴(yán)重的基線漂移也就不可避免，見(jiàn)圖1A。眾所周知，基線漂移不但有等性的，還有非等性的。而這些非等性的漂移基線是隨信號(hào)的增強(qiáng)而增強(qiáng)，見(jiàn)圖1B。采取常用的擬合等性漂移基線去扣除信號(hào)峰中包含的基線漂移，對(duì)于高含量組分準(zhǔn)確度的影響是可以忽略不計(jì)的，但是對(duì)于代謝組學(xué)中所關(guān)注的內(nèi)源性代謝物信號(hào)的增加或者降低，通常這種變化的程度是較弱的，特別是中藥毒性或者藥效引起的變化會(huì)是更弱，因此組分峰中基線漂移的準(zhǔn)確消除就顯得特別重要[11]。我們研究組基于LC-MS中MS的高度選擇性(即近似于線狀的質(zhì)譜峰)提出了一種確定真實(shí)色譜基線并消除基線漂移的方法[11]。其基本思想和方法為：在LC-MS/MS的二維數(shù)據(jù)矩陣中，每一個(gè)m/z均對(duì)應(yīng)一個(gè)色譜矢量，在所檢測(cè)的m/z范圍內(nèi)，由于MS的高度選擇性，必然導(dǎo)致了大量的被檢的m/z處并沒(méi)有碎片離子的質(zhì)譜信號(hào)，這些m/z處的色譜矢量即就是色譜基線，它是全部保留時(shí)間范圍內(nèi)的色譜基線，即真實(shí)的色譜基線；以信噪比(S/N)≥3為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)一個(gè)色譜矢量的所有元素進(jìn)行比較，當(dāng)均為噪聲時(shí)，該色譜矢量即為相應(yīng)m/z下的色譜基線矢量；對(duì)確定的所有m/z下的色譜基線取平均，作為該檢測(cè)樣本的色譜基線，以實(shí)現(xiàn)基線扣除。對(duì)于Sil組，以此方法獲得了所有樣本的總離子流色譜的平均基線，結(jié)果參見(jiàn)圖1B。可以發(fā)現(xiàn)，基線漂移的非等性特別嚴(yán)重，將會(huì)導(dǎo)致代謝組學(xué)模型的嚴(yán)重偏離。以此基線，扣除基線漂移，結(jié)果參見(jiàn)圖1A?？梢园l(fā)現(xiàn)，色譜的基本形狀沒(méi)有改變，但是相對(duì)高度發(fā)生了變化，這正是非等性所引起的；同時(shí)，基線的漂移也被有效消除。

2.2 消除外源性代謝物信號(hào)

相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)源性代謝物譜是機(jī)體正常生理狀態(tài)的反映，當(dāng)發(fā)生病理性或者毒理性變化時(shí)，它將發(fā)生偏離，這就是代謝組學(xué)模型的基礎(chǔ)。然而，機(jī)體的代謝樣本，比如常用的尿液和血液，既有內(nèi)源性代謝物，又有外源性代謝物，如常見(jiàn)的藥物代謝物，多出來(lái)的外源性代謝物的檢測(cè)信號(hào)明顯降低了代謝組學(xué)模型的準(zhǔn)確度。對(duì)于本文中大鼠尿液樣本，檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖2?？梢园l(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，給藥組由于藥物代謝物的存在，導(dǎo)致多出現(xiàn)了色譜峰(圖2A)。以6～9 min為例，在其放大圖(圖2A內(nèi)插圖)中可明顯地觀察到，給藥組中多出了保留時(shí)間約為6.9、7.6、7.8和8.5 min的4個(gè)外源性代謝組分峰(圖中箭頭標(biāo)注)。與對(duì)照組比較，給藥組中內(nèi)源性代謝物信號(hào)的增強(qiáng)或者減弱程度，明顯小于多出來(lái)的外源性代謝物信號(hào)強(qiáng)度，它將嚴(yán)重削弱內(nèi)源性代謝物信號(hào)的變化對(duì)代謝組學(xué)模型的貢獻(xiàn)率，從而導(dǎo)致代謝組學(xué)模型對(duì)毒性和藥效的準(zhǔn)確表征和靈敏表征。對(duì)于中藥的弱毒和弱效，這種影響將更為嚴(yán)重，甚至代謝組學(xué)模型將可能得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

據(jù)此，基于組分間質(zhì)譜信號(hào)正交性，我們研究組建立了基于質(zhì)譜的正交投影(MSOP)方法，消除給藥樣本數(shù)據(jù)中的外源性代謝物檢測(cè)信號(hào)[10]。該方法的基本思想和方法為[10]：在LC-MS矩陣數(shù)據(jù)中，對(duì)于同一保留時(shí)間的質(zhì)譜矢量，與對(duì)照組比較，給藥樣本中包括了兩類碎片離子。第1種，m/z與對(duì)照組相同，但質(zhì)譜強(qiáng)度可以相同，也可以不同，這些碎片離子就是“內(nèi)源性代謝物組分質(zhì)譜”，它們僅僅是表征了濃度的變化；第2種，比對(duì)照組多出的碎片離子，即就是外源性代謝物組分的質(zhì)譜。此時(shí)，當(dāng)用對(duì)照樣本的質(zhì)譜矢量構(gòu)建的MSOP去投影給藥樣本的同一保留時(shí)間的質(zhì)譜矢量時(shí)，給藥樣本中與對(duì)照樣本相同組分(內(nèi)源性代謝物)的質(zhì)譜就被消除，殘差矢量即為給藥樣本中多出現(xiàn)的差異性組分的信號(hào)，即外源性代謝物的質(zhì)譜。不同保留時(shí)間重復(fù)該正交投影，將獲得給藥樣本檢測(cè)信號(hào)矩陣中包含的外源性代謝物信號(hào)矩陣。通過(guò)信號(hào)扣除，即可獲得給藥樣本的內(nèi)源性代謝物信號(hào)矩陣。對(duì)于本文的尿液樣本，從檢測(cè)信號(hào)中用MSOP法消除外源性代謝物信號(hào)，結(jié)果參見(jiàn)圖2B。同樣也以6～9 min為例，在其放大圖(圖2B內(nèi)插圖)中可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，給藥組中明顯多出來(lái)的那4個(gè)外源性代謝組分峰已經(jīng)被消除，同時(shí)所有的組分能夠基本對(duì)應(yīng)，僅僅表現(xiàn)出的是“量的多與少”，這也正是代謝組學(xué)所關(guān)注的組分。從整個(gè)色譜(圖2B)來(lái)看，也是反映的這種“量的多與少”的特征，由此說(shuō)明給藥樣本中的藥物代謝物信號(hào)已經(jīng)被有效消除。

圖2 消除外源性代謝物前(A)和后(B)的總離子流平均色譜圖Fig.2 Average total ion chromatograms before(A) and after(B) eliminating exogenous metabolitesLine a:Group Sil;Line b:Group Con;Inset:partially enlarged.

2.3 代謝組學(xué)模型與治療評(píng)價(jià)

對(duì)于獲得的內(nèi)源性代謝物譜，常用PCA和PLS建立代謝模型。PLS是有監(jiān)督的分類，適用于變量對(duì)分類貢獻(xiàn)明確的情況，如以標(biāo)記物作為變量。而無(wú)監(jiān)督的分類方法PCA適用于變量對(duì)分類貢獻(xiàn)不明確的情況，以此進(jìn)行模型分類，并以此模型去發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物[10,11]。據(jù)此，我們以獲得的內(nèi)源性代謝物總離子流色譜為識(shí)別變化，經(jīng)濃度歸一化處理后，利用PCA方法，建立了四氯化碳肝損傷代謝組學(xué)模型(圖3)。從圖3A可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組發(fā)生了明顯偏離，它們被分為了兩類模式識(shí)別樣本，表明四氯化碳肝損傷導(dǎo)致了內(nèi)源性代謝物譜偏離正常的生理狀態(tài)，表現(xiàn)出了明顯的肝損傷病理特征。在正常對(duì)照組中，其中一個(gè)樣本被分類到了模型組中，其統(tǒng)計(jì)行為與正常組不一致，應(yīng)該作為奇異樣本。事實(shí)上，PCA模型的分類與肝組織顯微成像特征是一致的。對(duì)照組(圖3B)肝細(xì)胞肝小葉和肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀規(guī)則有序排列；四氯化碳造模后(圖3C)肝細(xì)胞出現(xiàn)了較大程度的脂肪性病變，肝細(xì)胞腫脹呈圓形，呈現(xiàn)空泡樣變性，細(xì)胞核體積增大被擠向一側(cè)，胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴，中央靜脈及匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明四氯化碳致大鼠肝組織損傷造模成功，這與代謝組學(xué)PCA模型的結(jié)論一致。與血清生化指標(biāo)的結(jié)論也相符合。在四氯化碳造模后，與對(duì)照組比較，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)酶活性有明顯升高，分別從33.13±9.13升高到86.90±36.76 IU/L，以及從48.95±12.18升高到145.22±32.02 IU/L，均表現(xiàn)出了明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明，獲得的內(nèi)源性代謝物譜能夠準(zhǔn)確地表征機(jī)體的毒理狀態(tài)，據(jù)此建立了準(zhǔn)確的肝損傷代謝組學(xué)模型。

圖3 水飛薊賓治療肝損傷的基于PCA的代謝組學(xué)模型(A)及其Con組(B)、Mol組(C)和治療后的Sil組(D)的肝組織顯微圖像:Con組；：Mol組；治療前(Ο)的后(*)的Sil組Fig.3 Silybin-treated PCA based metabonomics model of liver injury(A) and their microscopic images of liver tissue for Groups Con(B),Mol(C),and treated Sil(D)?:Group Con;△:Group Model(Mol);Groups Sil before(Ο) and after(*) treating with silybin.

對(duì)于水飛薊賓治療的同一組動(dòng)物，為了與臨床治療一致，也首先四氯化碳造模，結(jié)果見(jiàn)圖3A中給藥組治療前的樣本，這些樣本與模型組的分類一致，表明給藥組治療前的內(nèi)源性代謝物譜特征與模型組一致。當(dāng)給予水飛薊賓治療之后，樣本分類與正常對(duì)照組重疊，表明經(jīng)過(guò)治療后的內(nèi)源性代謝物譜特征與正常對(duì)照組一致，給藥組的肝損傷回調(diào)到了正常對(duì)照組，說(shuō)明肝損傷得到了恢復(fù)。肝組織顯微成像(圖3D)也證實(shí)了此結(jié)論?？梢园l(fā)現(xiàn)，四氯化碳造模導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂肪性、形態(tài)學(xué)以及炎性病變均消失，與對(duì)照組沒(méi)有顯性差異(圖3B)。從血清生化指標(biāo)可見(jiàn)，與模型組比較，ALT及AST酶活性有一定回調(diào)，分別從86.90±36.76 IU/L降低到74.99±24.98 IU/L，以及從145.22±32.02 IU/L，降低到88.08±36.25IU/L，但是均未回調(diào)至正常對(duì)照組的水平。這種回調(diào)是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，也說(shuō)明給藥組模型動(dòng)物的肝損傷獲得了一定療效。眾所周知，“非損傷性的”血清生化檢測(cè)的敏感性明顯弱于“損傷性的”肝組織顯微成像，也正是如此，組織活檢通常作為臨床診療的金標(biāo)準(zhǔn)。而PCA代謝組學(xué)與活檢結(jié)論是一致的，這也從此實(shí)例證實(shí)了通常所認(rèn)為的“代謝組學(xué)具有高靈敏度”的結(jié)論。這種療效評(píng)價(jià)的靈敏性對(duì)于中藥“溫和”療效的評(píng)價(jià)尤其重要。說(shuō)明代謝組學(xué)還具有了血清生化檢測(cè)作為常規(guī)檢測(cè)的顯著特征“方便性、持續(xù)性”。這也是組織活檢不能作為常規(guī)檢測(cè)的根本原因。綜上可知，內(nèi)源性代謝物譜也能夠準(zhǔn)確地表征治療過(guò)程的病理狀態(tài)，構(gòu)建的代謝組學(xué)模型評(píng)價(jià)水飛薊賓治療肝損傷療效的方法具有非損傷性、準(zhǔn)確性、靈敏性和方便持續(xù)性的顯著特點(diǎn)。

經(jīng)過(guò)PCA分析后，獲得了分類模型的載荷矩陣，其中的每一個(gè)載荷矢量表征了相應(yīng)的保留時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性代謝物的色譜組分(即質(zhì)譜矢量)對(duì)分類的貢獻(xiàn)，也就是對(duì)藥效或者毒性表達(dá)的貢獻(xiàn)，該矢量模的數(shù)值越大貢獻(xiàn)就越大，據(jù)此可計(jì)算得到每一個(gè)色譜組分的貢獻(xiàn)率。以貢獻(xiàn)率值≥0.15%為標(biāo)準(zhǔn)，從1 667個(gè)色譜組分中找出了119個(gè)，作為高貢獻(xiàn)組分(圖4A)，這也僅僅占到7.1%的色譜組分?jǐn)?shù)，其它92.9%的色譜組分作為低貢獻(xiàn)組分。以高貢獻(xiàn)組分作為標(biāo)記物，建立了有監(jiān)督的模式識(shí)別模型，即PLS-DA代謝組學(xué)模型(圖4B)?？梢园l(fā)現(xiàn)，在PCA模型中的結(jié)論同樣也能夠在此模型中呈現(xiàn)，說(shuō)明以極少的標(biāo)記物是可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥療效的靈敏評(píng)價(jià)。

圖4 色譜組分對(duì)分類的貢獻(xiàn)率(A)及其基于標(biāo)記物的PLS -DA代謝組學(xué)模型(B)Fig.4 Contribution ratios of chromatographic components to the classification(A) and the marker basedPLS-DA metabonomics model(B) ?:Group Con;△:Group Mol;Groups Sil before(Ο) and after(*) treating with silybin.

3 結(jié)論

利用四氯化碳致肝損傷動(dòng)物模型，以尿液為樣本，獲得了色譜-質(zhì)譜二維矩陣數(shù)據(jù)。利用基于質(zhì)譜選擇性和正交性構(gòu)建的色譜基線漂移和外源性代謝物信號(hào)的消除方法，獲得了內(nèi)源性代謝物總離子流色譜，據(jù)此建立了肝損傷的代謝組學(xué)模型。模型表達(dá)的四氯化碳致毒特征與組織細(xì)胞顯微特征和血清學(xué)指標(biāo)一致。對(duì)于肝損傷的模型動(dòng)物，當(dāng)給予中藥提取物水飛薊賓治療時(shí)，肝損傷具有明顯的回調(diào)趨勢(shì)，治療前的代謝組學(xué)分類特征與模型組一致，治療后與正常對(duì)照組一致，均與肝組織顯微成像特征一致。然而，血清學(xué)指標(biāo)雖然也明顯回調(diào)，但還未回調(diào)到正常狀態(tài)。由此表明，代謝組學(xué)肝損傷療效評(píng)價(jià)的靈敏性與“損傷性的”作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的組織顯微成像一致，而明顯高于常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)。因此，本文獲得的內(nèi)源性代謝物譜準(zhǔn)確地表征了致毒過(guò)程的毒理狀態(tài)和治療過(guò)程的病理狀態(tài)。建立的代謝組學(xué)模型實(shí)現(xiàn)了非損傷、準(zhǔn)確、靈敏、方便持續(xù)的中藥治療評(píng)價(jià)。