費(fèi) 丹， 王夢芝， 周瑤敏， 謝 敏， 胡麗芳， 鄭小明，周日龍， 閔佳玲， 余云云， 徐 俊*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，江西南昌 330200；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3.江西省玉山黑豬原種場，江西上饒 334700)

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)QS)是在喹啉環(huán)的6位上加入了氟原子，7位上連有哌嗪基的一類衍生物[1,2]。在獸醫(yī)臨床上，常作為細(xì)菌感染類疾病的治療藥物，具有抗菌譜廣、高效、低毒、促生長等優(yōu)點[3,4]。然而，在動物養(yǎng)殖過程中經(jīng)常出現(xiàn)超劑量、超范圍使用，使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[5]。與此同時，氟喹諾酮類藥物殘留造成的食品安全問題層出不窮，殘留有藥物的畜禽產(chǎn)品通過食物鏈傳遞可能對人體產(chǎn)生一系列危害，如造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，使人出現(xiàn)失眠、頭痛及驚厥等癥狀，嚴(yán)重的還會引發(fā)光毒性、肝腎毒性和溶血性貧血等疾病[6]。鑒于此，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2015年發(fā)布了2292號公告，要求停止在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星這4種獸藥。然而，近幾年風(fēng)險評估研究發(fā)現(xiàn)這4種違禁藥物依然在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用，尤其是養(yǎng)殖戶為了逃避農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管，常在養(yǎng)殖前端過程中使用，而畜禽在屠宰上市時由于藥物自身代謝作用，常規(guī)的快檢設(shè)備無法檢出藥物殘留，這無形中給畜禽產(chǎn)品養(yǎng)殖全過程的質(zhì)量安全監(jiān)管帶來了難題。

當(dāng)前，氟喹諾酮類藥物的分析檢測手段主要包括分光光度法、放射免疫法(RIA)、微生物法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、電解分析法、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等[7 - 11]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法尤其對復(fù)雜樣品具有較高的分離能力，并且選擇性強(qiáng)、靈敏度高，能夠提供相對分子量和結(jié)構(gòu)信息，因此是目前獸藥殘留等痕量分析的主要方法[12,13]。由于氟喹諾酮類抗生素特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，容易生成正離子，因此流動相中常添加甲酸，以此來提高離子化效率。檢測基質(zhì)主要包括畜禽肌肉組織、雞蛋、血漿、內(nèi)臟或獸藥等[14 - 16]。其中，肌肉、內(nèi)臟、血液需要通過屠宰動物的方式來獲取樣品，其成本高、步驟繁瑣。收集畜禽毛發(fā)樣品不僅可以避免動物被屠宰，并且取樣簡便、易于保存；此外，毛發(fā)組織中沒有血液循環(huán)和降解藥物的活性物質(zhì)以及高效的排泄方式，因此藥物的代謝緩慢，并且在毛發(fā)中的殘留時間比其他組織更長，有利于養(yǎng)殖過程中對違禁藥物使用的高效監(jiān)管[17]。

目前，已有關(guān)于人頭發(fā)中農(nóng)藥[18]殘留檢測，以及畜禽毛發(fā)中利巴韋林[19]、氟蟲腈[20]等藥物殘留檢測的研究報道，而有關(guān)畜禽毛發(fā)中培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和諾美沙星4種違禁氟喹諾酮類藥物的檢測方法鮮有報道。本研究通過乙腈-乙酸混合提取，采用PSA/C18凈化管進(jìn)行基質(zhì)分散凈化，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離，電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式測定，建立了畜禽毛發(fā)中上述4種違禁氟喹諾酮類獸藥殘留量的檢測方法，為畜禽產(chǎn)品在養(yǎng)殖過程中的高效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290-6495超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；MS205DU電子分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；GL-88B型旋渦混合器(海門市Qilinbeier公司)；KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山HeChuang Ultrasonic公司)；電熱恒溫干燥箱(上海HeDe Laboratory公司)；離心機(jī)(上海SH-AnTing公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國，Organomation公司)；0.22 μm尼龍濾膜(美國，Agilent公司)；Milli-Q超純水器(Millipore公司)；固相萃取裝置(美國，Supelco公司)。

培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星-D5、氧氟沙星-D3、諾氟沙星-D5、洛美沙星-D5(美國Sigma-Aldrich公司)；十八烷基硅烷(C18，粒徑40～60 μm，上海阿拉丁公司)；色譜純甲酸、甲醇、乙腈(美國Fisher試劑公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS，上海Macklin公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA，粒徑40～60 μm，美國Welchrom公司)；HLB固相萃取柱(美國Waters公司)；其余試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1.0 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取適量培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星及其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成1.0 mg/mL的單標(biāo)儲備溶液，置于-20 ℃下避光儲存。標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10.0 mg/L)：分別移取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的單標(biāo)中間溶液，置于-20 ℃下避光儲存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(1.0 mg/L)：取上述標(biāo)準(zhǔn)中間溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，置于-20 ℃下避光儲存；取上述同位素內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的同位素內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，置于-20 ℃下避光儲存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液(100.0 μg/L)：取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液5 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于4 ℃下避光儲存；取上述同位素內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液5 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100.0 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于4 ℃ 下避光儲存。

1.3 樣品制備

實驗所用牛毛采自當(dāng)?shù)厝馀ｐB(yǎng)殖場，培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星檢測結(jié)果均為陰性。

毛發(fā)的清洗：使用濃度1%SDS溶液浸泡毛發(fā)30 min，隨后用水漂洗多次至漂洗液澄清，置于40 ℃恒溫烘箱1 h后，取出晾干，剪碎成1～2 mm，存放于干燥器中，備用。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取50 mg經(jīng)上述處理后的毛發(fā)樣品于15 mL離心管中，滴加濃度為100.0 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)溶液20 μL和5 mL 1%乙酸-乙腈溶液。室溫下超聲反應(yīng)30 min，于5 000 r/min離心5 min，取上層清液至事先已加入100 mg PSA和100 mg C18吸附劑的15 mL離心管中，渦旋30 s后于5 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在45 ℃條件下氮?dú)獯抵两桑尤? mL流動相(0.1%甲酸水溶液)溶解，使用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，待上機(jī)檢測。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)(Agilent)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序為：0～1 min，B保持10%；1～5 min，B由10%線性升至50%；5～6 min，B由50%線性降至10%；6～6.5 min，B保持10%。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。

1.6 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧電離正離子(ESI+)模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：3 000 V；離子源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：150 ℃；干燥氣流量：15 L/min；霧化氣壓力：30 psi；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：11 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果

隨著超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在藥物殘留檢測的廣泛應(yīng)用，使得分析檢測更高效靈敏，尤其適合大批量樣品的分析檢測[21]。本研究采用超高效液相色譜，以0.1%甲酸水溶液-甲醇做流動相，分離4種違禁氟喹諾酮類獸藥，通過質(zhì)譜定性及定量檢測。根據(jù)氟喹諾酮類化學(xué)結(jié)構(gòu)特點，容易得到H+而形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，故本研究選擇正離子模式檢測，建立畜禽毛發(fā)中4種氟喹諾酮類藥物殘留的定性定量檢測方法。該方法分離效果較好，結(jié)果見圖1。

圖1 培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星及其內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)的定量離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of quantitative ion for pefloxacin,ofloxacin,norfloxacin,lomefloxacin and their internal standards

采用內(nèi)標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量分析，在一定程度上可消除因為操作條件和檢測儀器帶來的誤差，進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，適用于畜禽毛發(fā)樣品中培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星這4種違禁氟喹諾酮類獸藥殘留的痕量分析檢測。檢測參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)檢測參數(shù)Table 1 Detection parameter of target compounds and the internal standard

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取方法優(yōu)化畜禽毛發(fā)結(jié)構(gòu)致密，藥物通常殘留于毛髓質(zhì)中，外部有較厚的角質(zhì)層包裹，因此需采用剪碎研磨的處理方式，使毛發(fā)的角質(zhì)層破碎，毛髓質(zhì)中藥物呈游離態(tài)進(jìn)入提取溶液，通過水解的處理方式破壞毛發(fā)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使藥物從中釋放出來。依據(jù)畜禽毛發(fā)樣品的吸附特性和氟喹諾酮類藥物的溶解性，對毛發(fā)中培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星的提取溶劑進(jìn)行了優(yōu)化。分別在毛發(fā)樣品中加入2%甲酸甲醇溶液、乙腈-50%HCl(1∶1,V/V)、乙腈-1%HAc溶液、乙腈-2%甲酸溶液、乙腈-磷酸鹽溶液，并添加50 μL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余步驟按“1.4”處理，研究不同提取溶劑的加標(biāo)回收率。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)乙腈-1%HAc溶液超聲提取后樣品色譜峰雜質(zhì)干擾最小，可以最大程度地去除毛發(fā)的基質(zhì)成分，其回收率均高于其他4種提取溶劑，因而將乙腈-1%HAc溶液作為本實驗的提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑的回收率Fig.2 Recovery of different extraction solvents

對比分析了不同水浴溫度和超聲振蕩時間對培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星的提取效果，篩選出3組較優(yōu)的方案進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。制備了添加50 μL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的樣品，用乙腈-1%HAc溶液提取后，分別經(jīng)25 ℃水浴超聲振蕩2 h、65 ℃水浴超聲振蕩2 h、80 ℃水浴超聲振蕩1 h處理，然后在5 000 r/min下離心5 min，取200 μL上清液，再加入800 μL初始流動相(0.1%甲酸甲醇溶液)混勻，濾膜過濾后上機(jī)檢測。3種不同水解條件下4種目標(biāo)物的回收率如圖3所示，水浴溫度25 ℃和65 ℃的提取回收率高于80 ℃提取條件，可見升高水浴溫度后目標(biāo)化合物的提取效果不佳。考慮實驗操作條件的簡便和節(jié)能因素，最終選擇25 ℃條件下水浴超聲振蕩2 h。

圖3 不同水解方法的回收率Fig.3 Recovery of different hydrolysis methods

2.2.2 凈化方法優(yōu)化水解反應(yīng)后的毛發(fā)產(chǎn)物一般要進(jìn)行提取及凈化處理，以此來降低干擾物對檢測的影響，并達(dá)到濃縮分析物的目的。通常采用液-液提取(LLE)和固相萃取(SPE)的方式完成提取和凈化步驟。其中，SPE多數(shù)使用NH2、SCX、C18、GCB及混合模式(C18+SCX)等[22,23]。本方法選擇PSA/C18凈化管和HLB固相萃取柱分別對毛發(fā)提取液進(jìn)行凈化，對比兩種方法的加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示，經(jīng)PSA/C18凈化管處理的樣品回收率和凈化效果較好，因此選用PSA/C18凈化管進(jìn)行毛發(fā)提取液凈化。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

本文選擇經(jīng)樣品前處理后的空白基質(zhì)和純?nèi)軇┓謩e稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用二者的斜率計算基質(zhì)效應(yīng)，即：(空白基質(zhì)液標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%，該值為負(fù)數(shù)表示基質(zhì)對化合物的響應(yīng)有抑制作用，該值為正數(shù)表示基質(zhì)對化合物的響應(yīng)有增強(qiáng)作用，其絕對值越大抑制或增強(qiáng)的作用越強(qiáng)。實驗結(jié)果表明，基質(zhì)效應(yīng)對4種化合物均為抑制作用，但影響不大，具體見表2。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

采用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中同位素內(nèi)標(biāo)濃度為2 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表2。4種目標(biāo)化合物在0.2～20 μg/L范圍內(nèi)成線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.993，線性良好，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比(S/N)為3和10時的濃度分別定為目標(biāo)化合物的檢測限和定量限，結(jié)果得出氧氟沙星和諾氟沙星的檢測限為0.05 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg；洛美沙星和培氟沙星的檢測限為0.08 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg(表2)。

2.5 回收率和精密度

參照方法定量限，在陰性樣品中添加了由低到高3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，每個濃度做6組平行實驗，分別計算加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。本方法回收率在87.09%～114.95%范圍內(nèi)，RSD在0.13%～4.92%之間。Xiang等[24]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測雞毛中的諾氟沙星殘留，方法檢出限為0.3 g/kg，定量限為1.0 g/kg，回收率為89.2%～95.7%，RSD均小于10%。本實驗結(jié)果與其結(jié)果相似，方法滿足畜禽毛發(fā)中氟喹諾酮類藥物的分析檢測。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線，基質(zhì)效應(yīng)，回收率，檢出限(LOD)和定量限(LOQ)Table 2 Standard curve equation,matrix effect,recovery,LOD and LOQ

2.6 實際樣品檢測

應(yīng)用所建立的方法，在農(nóng)貿(mào)市場共采集9份麻雞毛發(fā)樣品和3份肉牛毛發(fā)樣品進(jìn)行檢測。檢出2份麻雞毛發(fā)中殘留氧氟沙星，其殘留水平為0.2651 μg/kg和0.2768 μg/kg。2份麻雞毛發(fā)陽性樣品檢測色譜圖見圖4，檢出氧氟沙星的陽性樣品色譜峰形良好。

圖4 實際樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of actual sample

3份肉牛毛發(fā)樣品均未發(fā)現(xiàn)存在培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星殘留。說明毛發(fā)可作為畜禽使用氟喹諾酮類藥物的檢測基質(zhì)，適用于畜禽養(yǎng)殖的全過程監(jiān)管。由此可見，上述所建立的方法具有很強(qiáng)的實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了一種利用畜禽毛發(fā)檢測培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星4種違禁氟喹諾酮類獸藥的分析方法。該方法前處理簡單，檢測限及定量限較低，有效地提供了一種借助畜禽毛發(fā)來監(jiān)管養(yǎng)殖過程中違禁藥物培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星等違規(guī)使用的新思路，為畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供了新的技術(shù)手段。