熊思元， 張智慧， 高文杰*， 劉 欣*

(1.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，湖北武漢 430074；2.武漢洪山區(qū)疾病預防控制中心，湖北武漢 430064)

2019年發(fā)布的最新全國癌癥報告數(shù)據(jù)顯示，肝癌已經(jīng)成為我國第四大常見癌癥，而其死亡率位于所有惡性癌癥的第二位[1]。盡管肝癌的診斷和治療技術(shù)有了長足的發(fā)展，肝癌病人的5年存活率依然不盡人意。對于肝癌的治療，不管是手術(shù)還是化療都容易復發(fā)。而在化療過程中，肝癌細胞產(chǎn)生耐藥性是影響化療結(jié)果的重要因素，這會因肝癌細胞抵抗化療藥物而導致化療的失敗。因此，如何解決腫瘤細胞的耐藥性已經(jīng)成為其治療過程中的關(guān)鍵問題。腫瘤細胞耐藥的產(chǎn)生包括多種復雜的機制，主要集中在：膜轉(zhuǎn)運蛋白高表達而增加抗癌藥物的外排；增強損傷DNA自我修復能力；細胞內(nèi)某些受體數(shù)量及其功能的改變等[2]。雖然國內(nèi)外的研究者進行了很多的探索，但仍未完全了解其中的機理。

糖基化是最常見且復雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。在真核生物細胞中，有超過50%的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化修飾[3]。蛋白質(zhì)的糖基化修飾在生物體的生命活動中發(fā)揮著多種功能，例如細胞信號轉(zhuǎn)導，免疫識別，病原體感染等[4 - 8]。近年來細胞N-連接聚糖與腫瘤耐藥的相關(guān)性研究日益引起人們的關(guān)注。Kudo等[9]首次報道了肝癌耐藥細胞與其親本細胞中N-連接聚糖的差異分析，研究結(jié)果顯示：與母本細胞相比，耐藥細胞中GnT-V表達下降，三支天線的N-連接聚糖增加，預示N-聚糖與肝癌細胞耐藥具有一定相關(guān)性。

由于糖蛋白N-連接聚糖具有多樣性及微觀不均一性的特點，加之糖蛋白在總蛋白中的豐度很低，這些因素都增加了聚糖分析和表征的難度。質(zhì)譜因其高靈敏度和高準確性的特點被廣泛應用于糖蛋白聚糖的分析。然而，聚糖的多羥基帶來的親水特性使其在質(zhì)譜分析時的離子化效率較低，并且在分析帶唾液酸的聚糖時會因為源內(nèi)解離或源后解離，而給聚糖的完整分析帶來一定困難。因此，對聚糖進行化學衍生是常用的提高聚糖檢測靈敏度的手段。

本文通過以Bel-7402細胞和其耐藥株Bel-7402/5-FU細胞為研究對象，使用本課題組開發(fā)的快速PNGase F酶切，結(jié)合TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生方法，比較了兩者的總蛋白和分泌蛋白的N-連接聚糖的差異性，為進一步探索肝癌細胞耐藥的診斷提供糖鏈標志物起到一定的參考作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TOF/TOF5800基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜儀(美國，Sciex公司)；Triple TOF 5600液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Sciex公司)。

Bel-7402肝癌細胞和耐5-FU的Bel-7402/5-FU肝癌細胞由本實驗室培養(yǎng)。(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)購買自美國Sigma公司；乙腈、甲醇購買自美國TEDIA公司；十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)購買自上海阿拉丁生化科技有限公司；RIPA裂解液購買自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；N-糖酰胺酶F(PNGase F)購買自江蘇愚公生命科技有限公司；其他分析純試劑購買自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

Bel-7402和Bel-7402/5-FU均在含10%(V/V)胎牛血清，以及100 U/mL雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不同的是Bel-7402/5-FU在培養(yǎng)基中要加入終濃度為10 μg/mL的5-FU以維持其耐藥性。

1.3 細胞蛋白抽提

1.3.1 細胞總蛋白抽提向收集的細胞中加入200 μL冰的RIPA裂解液，輕微混懸之后在4 ℃下孵育15 min，然后用超聲破碎儀在冰上進一步破碎。用轉(zhuǎn)速為15 000 r/min的高速離心機對細胞裂解液離心5 min，取上清液溶用于細胞總蛋白的抽提。使用有機溶劑沉淀法對細胞總蛋白進行抽提[10]。

1.3.2 分泌蛋白細胞培養(yǎng)到約70%覆蓋度時，換掉帶血清的培養(yǎng)基，并用1 mL無血清培養(yǎng)基洗5次，接著加入5 mL的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將含有分泌蛋白的無血清培養(yǎng)基移入到10 mL離心管中，用低溫高速離心機，于4 ℃下6 000 r/min離心10 min去掉細胞碎片。最后小心將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，同樣用有機溶劑沉淀法對分泌蛋白進行抽提。

1.4 快速酶切及TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生

N-聚糖的酶切和衍生使用本課題組之前提出的方法[11,12]。向抽提得到的細胞蛋白中加入50 μL含1%DDM,50 mmol/L DTT和0.1%SDS的50 mmol/L HEPES緩沖溶液(pH=8.0)?；靹蚝笤?00 ℃下煮沸2 min使蛋白質(zhì)變性，之后冷卻到50 ℃。然后向上述混合溶液中加入1.0 μL的PNGase F，并且在50 ℃下反應5 min。向上述溶液中加入50 μL用乙腈溶解的現(xiàn)用現(xiàn)配的TMPP-Ac-OSu，在40 ℃下反應20 min。纖維素柱純化，洗脫液旋蒸后進行甲胺化衍生，繼續(xù)過纖維素柱純化除鹽。

1.5 質(zhì)譜檢測

1.5.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析制備好的樣品溶于10 μL 50%甲醇溶液，取0.5 μL樣品與0.5 μL 10 mg/mL的CHCA溶液(溶于70%乙腈中)混合后點到靶板上，待樣品干燥后進行檢測。儀器相關(guān)參數(shù)設置如下：檢測模式：正離子反射模式(Reflector Positive)；加速電壓：20 kV；激光強度：5 000；掃描范圍：m/z1 000～5 000。數(shù)據(jù)由軟件Data Explore 4.5解析。

1.5.2 納升液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜(NanoLC-ESI-MS/MS)分析納升液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜儀由Analyst進行系統(tǒng)控制，質(zhì)譜的電離模式為正離子模式；電噴霧的電壓設定為2 300 V；去簇電壓為100 eV；接口溫度為150 ℃。一級質(zhì)譜的掃描范圍：m/z400～2 000，電荷數(shù)范圍：2～5，母離子的積累時間：0.25 s。母離子中豐度最高的5個離子用于后續(xù)的二級質(zhì)譜檢測。二級質(zhì)譜的掃描范圍：m/z100～2 000；檢測模式為IDA(Information Dependent Acquisition)，四極桿碰撞池能量為40 eV，積累時間為0.1 s。數(shù)據(jù)由軟件Peakview1.2解析。

2 結(jié)果與討論

2.1 細胞形態(tài)學差異

使用光學顯微鏡對兩種細胞在形態(tài)學上的差異進行了分析。Bel-7402細胞呈不規(guī)則多邊形，明顯的上皮樣細胞形態(tài)。而Bel-7402/5-FU細胞的形態(tài)與之有明顯不同，呈分片樣，棱角減少且往梭形樣發(fā)展，細胞質(zhì)清亮，折光性增強，有些細胞有細長的偽足狀結(jié)構(gòu)。

2.2 NanoLC-ESI-MS/MS糖型鑒定

使用NanoLC-ESI-MS/MS對本文中檢測到的N-連接聚糖進行結(jié)構(gòu)鑒定，并推測可能的糖型結(jié)構(gòu)。圖1所示為糖型質(zhì)荷比為m/z937.34[M+3H]3+和m/z1 042.40[M+3H]3+的二級質(zhì)譜圖，分別對可以確定糖型結(jié)構(gòu)的二級診斷離子用綠色數(shù)字進行了標注。如圖1(a)二級質(zhì)譜圖所示，305為唾液酸甲胺化衍生后的碎片離子，可以推測出該糖型中含有唾液酸；m/z512、674、1 977和1 252(+2)碎片離子，推測出該糖型中含有非核心巖藻糖存在；m/z1 466和1 628碎片離子推測出該糖型中還含有1個核心巖藻糖，進而推測出可能的糖型結(jié)構(gòu)為[Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]1[Fuc]2。

圖1 細胞中典型的N-連接聚糖二級質(zhì)譜圖。(a)為m/z937.34[M+3H]3+，推測糖型為[Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]1-[Fuc]2的二級質(zhì)譜圖；(b)為m/z1042.40[M+3H]3+,推測糖型為[Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]3的二級質(zhì)譜圖。Fig.1 Typical MS/MS spectra of the derivatized N-glycans from cells.(a)NanoLC-ESI-MS/MS spectrum of m/z937.34[M+3H]3+ with the composition of [Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]1[Fuc]2;(b)NanoLC-ESI-MS/MS spectrum of m/z 1042.40[M+3H]3+with the composition of [Hex]5[HexNAc]4[NeuAc]3.

表1所列為本文中鑒定到的可能的所有糖型及其對應的分子量。

表1 本文中使用MALDI-MS鑒定到的N-連接聚糖Table 1 N-glycans detected in this article by MALDI-MS

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.3 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細胞總蛋白N-連接聚糖分析

為了提高細胞聚糖檢測的靈敏度，采用本課題組開發(fā)的PNGase F快速酶切，結(jié)合TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生的方法[10,11]。圖2為Bel-7402和Bel-7402/5-FU兩種細胞總蛋白N-連接聚糖典型的MALDI質(zhì)譜圖。使用約105個細胞，即可從兩種細胞總蛋白中共檢測到56種N-連接聚糖。

圖2 Bel-7402(a)和Bel-7402/5-FU(b)細胞總蛋白N-連接聚糖的MALDI質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI mass spectra of cell total protein N-glycan profiling from Bel-7402(a) and Bel-7402/5-FU(b)

在比較兩種細胞總蛋白N-連接聚糖的差異之前，將所有糖型的信噪比進行歸一化處理，得到每個糖型在兩種細胞中的相對比例，結(jié)果如圖3(a)所示。為了比較三種細胞糖型在大的分類上的差異，將檢測到的糖型歸類為高甘露糖型、雜合型、復雜型和寡甘露糖型。Bel-7402細胞和其5-FU耐藥細胞總蛋白N-連接聚糖在這四類糖型中的比例分別是73.38%±1.13% vs 63.32%±1.24%；14.84%±0.94% vs 24.31±1.05%；4.65%±0.28% vs 7.13%±0.21%和7.13%±0.58% vs 5.24%±0.31%。從圖3(b)中可以看出，高甘露糖型N-聚糖在兩種細胞的總糖譜中都占了很大的比例。此外，還對含有較大差異的高甘露糖和巖藻糖化復雜糖中的單個糖型進行了逐一比較，結(jié)果如圖3(c)和3(d)所示。在Bel-7402細胞中，Man5-10GlcNAc2五種糖型的相對比例都比耐5-FU的Bel-7402細胞要高，這是之前文獻中沒有報道過的。而在核心巖藻糖化的復雜糖中，文獻報道多分支核心巖藻糖在耐藥細胞中的比例明顯增加，這與本文的結(jié)果相一致[12,13]。除此之外，還發(fā)現(xiàn)兩分支的巖藻糖化糖型在Bel-7402細胞中的相對比例比在5-FU耐藥的Bel-7402細胞高。

圖3 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細胞總蛋白中N-連接聚糖的差異分析。(a)為所有糖型；(b)為不同大類糖型；(c)單個高甘露糖型比較；(d)為核心巖藻糖化糖型在兩種細胞總蛋白N-連接聚糖中的差異分析。Fig.3 Differential analysis of N-glycans from total proteins between Bel-7402 and Bel-7402/5-FU cells.The difference in total N-glycans(a),four types(b),single high mannose(c)and core-fucosylation N-glycans(d) of two cell lines.

2.4 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細胞分泌蛋白N-連接聚糖分析

細胞分泌蛋白是生物活性糖蛋白的一個重要來源，分析細胞分泌蛋白的糖譜為科研工作者研究蛋白質(zhì)糖基化與腫瘤耐藥之間的關(guān)系提供了機會。通過對5 mL無血清培養(yǎng)細胞24 h后得到的分泌蛋白進行蛋白濃度測定，得到分泌蛋白約為30 μg。這一數(shù)值比之前文獻報道的分泌蛋白濃度偏高[14]?？赡艿脑蚴歉闻K是代謝旺盛的器官，因而肝細胞分泌蛋白的量更多一些。圖4所示為兩種細胞分泌蛋白N-聚糖的MALDI質(zhì)譜圖，共檢測到38種N-連接聚糖。

圖4 Bel-7402(a)和Bel-7402/5-FU(b)細胞分泌蛋白N-連接聚糖的MALDI質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI mass spectra of cellsecreted protein N-glycan profiling from Bel-7402(a) and Bel-7402/5-FU(b)

與細胞總蛋白N-連接聚糖分析相同，將分泌蛋白中所有糖型的信噪比進行歸一化處理，得到每個糖型在兩種細胞中的相對比例，結(jié)果如圖5(a)所示。同樣，將Bel-7402細胞和其5-FU分泌蛋白中檢測到的糖型歸類為高甘露糖型、雜合型、復雜型和寡甘露糖型。這四類糖型中在Bel-7402細胞和Bel-7402/5-FU中的比例分別是23.87%±1.57% vs 6.76%±0.54%；64.75%±1.41% vs 88.07±0.63%；10.75%±0.08% vs 4.92%±0.65%和0.62%±0.23% vs 0.23%±0.17%。從圖5(b)可以看出，與細胞總蛋白N-連接聚糖糖譜不同，細胞分泌蛋白的糖譜以帶唾液酸的復雜型聚糖為主，這與人血清中的N-連接聚糖糖譜類似，從側(cè)面說明了血清中蛋白多由細胞分泌到血液中。而細胞分泌蛋白中的高甘露糖型聚糖變化情況與細胞總蛋白相反，在5-FU耐藥細胞中顯著增加(圖5(c))。此前有文獻報道，耐藥細胞分泌蛋白中的核心巖藻糖化N-連接聚糖相比與母本細胞的比例顯著增加[9,13]，本文亦得到了相同的結(jié)論(圖5(d))。

圖5 Bel-7402和Bel-7402/5-FU細胞分泌蛋白中N-連接聚糖的差異分析。(a)為所有糖型；(b)為不同大類糖型；(c)單個高甘露糖型比較分析；(d)為核心巖藻糖化糖型在兩種細胞總蛋白N-連接聚糖中的差異分析。Fig.5 Differential analysis of N-glycans from secreted proteins between Bel-7402 and Bel-7402/5-FU cells.The difference in total N-glycans(a),four types(b),single high mannose(c)and core-fucosylation N-glycans(d) of two cell lines.

3 結(jié)論

使用快速PNGase F酶切，結(jié)合TMPP-Ac-OSu和甲胺化共衍生方法，對Bel-7402和Bel-7402/5-FU兩者的總蛋白和分泌蛋白的N-連接聚糖進行了MALDI質(zhì)譜的差異分析。5-FU與Bel-7402相比，耐藥細胞在總蛋白和分泌蛋白中的巖藻糖化唾液酸糖型顯著升高；高甘露糖型N-聚糖在總蛋白中下降，而在分泌蛋白中顯著增加。本研究為進一步探索肝癌耐藥提前診斷提供糖鏈標志物起到一定的參考作用，并為后續(xù)解決肝癌的治療的耐藥提供理論依據(jù)。