林仁義， 楊麗娟， 俞曉玲， 黃麗英

網(wǎng)絡(luò)藥理學是英國藥理學家Hopkins于2007年首次提出的[1]，它強調(diào)疾病的發(fā)生發(fā)展是一個長期、復(fù)雜的動態(tài)過程，復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)失衡才是疾病的本質(zhì)，即生物網(wǎng)絡(luò)中的基因或者其產(chǎn)物等多個靶點處于功能失衡的狀態(tài)[2]。從多成分、多靶點的研究思路出發(fā)，將藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，為新藥的研發(fā)提供新的方向，且當今多靶點藥物的研發(fā)也正逐漸成為一種新趨勢[3-4]。單靶點藥物在治療多因素疾病如腫瘤、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病時，往往難以達到預(yù)期效果，還可能引發(fā)毒副作用[5]。中藥及其復(fù)方的活性成分復(fù)雜多樣，能更好地發(fā)揮“多成分、多靶點、多通路”的協(xié)同作用，體現(xiàn)出整體治療的優(yōu)勢。

金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl. (A.roxburghii)]是蘭科開唇蘭屬多年生草本藥用植物，素有“金草”“神草”“藥之王”“鳥人參”等美譽，全草入藥，具有清熱涼血、解毒消腫、潤肺止咳等功效，廣泛用于治療肝炎、糖尿病、腫瘤等疾病[6]。本研究通過篩選金線蓮的主要活性成分和靶點，并挖掘核心靶點，旨在進一步系統(tǒng)地闡述金線蓮的藥用功效。

1 材料與方法

1.1 活性成分的收集與篩選 通過文獻檢索收集金線蓮的活性成分，利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫對每個活性成分的結(jié)構(gòu)進行確認，下載保存每個活性成分的三維(3D)結(jié)構(gòu)，文件保存格式為“.sdf”。將文件導(dǎo)入Swiss ADME (http://www.swissadme.ch/) 平臺，獲取每個活性成分的SMILES號，點擊Run查看運行結(jié)果。根據(jù)胃腸道吸收(gastrointestinal absorption，GI absorption)的高低指示口服生物利用度[7]、通過類藥性指標篩選出具有良好藥代動力學性質(zhì)的活性成分。借助該平臺，設(shè)定胃腸道吸收為“High”作為活性成分可被吸收的條件，進行口服生物利用度篩選；收集5種類藥性預(yù)測結(jié)果(Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge)中≥2個為“Yes”的化合物[8-9]，篩選后的活性成分作為預(yù)測金線蓮作用靶點的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2 靶點預(yù)測 Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)是小分子物質(zhì)預(yù)測靶點的在線分析平臺，其依據(jù)分子相似性原理和化學計量學方法預(yù)測化學物質(zhì)的作用靶點。選擇“Homo sapiens”，導(dǎo)入活性成分結(jié)構(gòu)文件，對篩選后的活性成分進行靶點預(yù)測。選取所有預(yù)測的靶點作為金線蓮活性成分的潛在作用靶點，利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行規(guī)范化。潛在作用靶點將用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) STRING 11.0(https://string-db.org/)是一款在線搜索已知PPI的數(shù)據(jù)庫，將潛在作用靶點信息輸入該數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，選取經(jīng)過實驗驗證的PPI關(guān)系，線型基于“evidence”。利用Cytoscape 3.8.0軟件中Network Analyzer插件分析該網(wǎng)絡(luò)。度值較大的靶點(≥5)為Hub蛋白，即高聯(lián)通的蛋白，根據(jù)中心致死率法則，高聯(lián)通蛋白對于維持復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)通性具有更加重要的意義[10]。

1.4 分子對接驗證 選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中的Hub蛋白進行分子對接驗證。采用藥物分子設(shè)計模擬軟件Sybyl-x2.0完成對接操作[11-12]。該軟件具有分析快速、準確的優(yōu)勢，通過Total-Score的打分數(shù)值可直觀看出活性物質(zhì)和靶點的結(jié)合強度，在Compute-Minimize-Molecule模塊下對每個篩選后的金線蓮活性成分進行Minimize能量優(yōu)化，優(yōu)化次數(shù)為10 000，能量收斂標準為0.05 kcal/(mol·nm)，添加Gasteiger Hückel電荷。從RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲取靶點蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)，并在Sybyl-x2.0軟件中的Surflex-Dock模塊完成AMBER7 F99力場能量優(yōu)化，加氫，并基于Ligand(配體)模式產(chǎn)生活性口袋?；钚猿煞趾桶悬c蛋白采用半柔性對接，利用Total-Score打分函數(shù)評價活性成分和靶點蛋白的結(jié)合強度及活性，Total-Score值越大，說明小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)的匹配結(jié)合能力越好。以Total-Score>5為閾值[13]，舍棄<5的對接結(jié)果，篩選出金線蓮活性成分的主要靶點。

1.5 靶點生物功能、通路富集分析 將金線蓮活性成分的主要靶點信息輸入David 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，通過“Functional Annotation Tool”模塊進行靶點GO富集分析和KEGG通路注釋分析，選擇“Homo sapiens”。金線蓮的主要靶點信息直接映射到通路當中，用于分析其參與的生物學過程與調(diào)節(jié)的人體通路。

1.6 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建金線蓮“活性成分-主要靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(Node)代表了“活性成分”“主要靶點”和“通路”。利用Cytoscape 3.8.0中Network Analyzer插件分析以上網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度(degree)、中心介度(betweenness centrality)及緊密度(closenesss centrality)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)篩選出核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.7 相關(guān)疾病的獲取 CTD(http://ctdbase.org/)比較毒物基因組學數(shù)據(jù)庫是一個強大的、公開的研究資源，是用于描述化學物質(zhì)、基因和人類疾病之間關(guān)系的科學數(shù)據(jù)庫，通過該數(shù)據(jù)庫查找核心靶點的相關(guān)疾病，選擇已有實驗驗證的“M( Marker/Mechanism)”或“T(Therapeutic)”的疾病為研究目標，統(tǒng)計整理可得金線蓮活性成分所參與治療的主要疾病。

2 結(jié) 果

2.1 金線蓮活性成分的獲取 經(jīng)百度學術(shù)(https://xueshu.baidu.com)、中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net)平臺檢索獲得30篇與金線蓮活性成分的相關(guān)文獻，整理獲得有效成分115個。因網(wǎng)絡(luò)藥理學的重點不在于討論量效關(guān)系，對于其有效成分的含量不作具體要求，檢索到的化合物一并列入。115個活性成分中，黃酮類化合物31個、揮發(fā)油類化合物44個、核苷類化合物13個、甾醇類化合物8個、三萜類化合物6個、多糖類化合物5個、生物堿類化合物2個、其他化合物6個。經(jīng)過“1.1”步驟篩選后共獲得45個有效成分(表1)。

表1 金線蓮活性成分篩選結(jié)果

2.2 潛在靶點的獲取，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)篩選后的45個有效成分，通過Swiss Target Prediction平臺預(yù)測潛在作用靶點，共獲得靶點528個。將所有靶點的信息輸入String 11.0平臺中，得到蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)中舍棄了沒有相互作用關(guān)系以及有相互作用關(guān)系但未經(jīng)實驗數(shù)據(jù)驗證、度值過小(<5)的靶點蛋白，剩余的靶點蛋白在維持復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)平衡中具有更大的潛力。網(wǎng)絡(luò)顯示，共有68個節(jié)點(靶點蛋白)，307條邊(相互作用關(guān)系)，度值越大，表明在該網(wǎng)絡(luò)中與其相互作用的靶點數(shù)量越多，所處地位越核心。68個靶點將通過分子對接驗證與其相應(yīng)的活性成分是否具有較好的結(jié)合能力。

圓圈代表靶點()，直線代表蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，藍色直線(—)表示作用關(guān)系來源于專業(yè)數(shù)據(jù)庫，紫色直線(—)表示作用關(guān)系來源于實驗結(jié)果。

2.3 分子對接驗證 利用Surflex-Dock進行分子對接具有準確性高、速度快的優(yōu)點。配體和受體的結(jié)合能力、穩(wěn)定性由Total-Score評價。Total-Score>5說明配體和受體具有較好的結(jié)合能力，>7說明兩者具有強烈的結(jié)合活性。對68個靶點以及對應(yīng)的活性成分共進行238次對接，結(jié)果顯示：Total-Score>7的有43個(18.07%)、5～7的有105個(44.12%)、<5的有90個(37.81%)，總體顯示有62.19%的對接結(jié)果具有較好或強烈的結(jié)合活性。保留評分結(jié)果≥5的靶點及其對應(yīng)的活性成分，最終獲得金線蓮主要靶點56個，分子對接結(jié)果見表2。

表2 分子對接結(jié)果

2.4 靶點生物功能、通路富集分析 為探究金線蓮主要靶點的生物學功能，運用DAVID數(shù)據(jù)庫對56個主要靶點進行生物富集(GO)和通路注釋(KEGG Pathway)分析，保留富集程度排名前20、P<0.01的條目(圖2)。GO分析包括生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。

A：生物過程；B：細胞組分；C：分子功能；D：通路注釋。圓點代表分析富集條目，其大小代表富集的基因數(shù)目，圓點顏色的深淺代表P值的大小。

2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、挖掘核心靶點 運用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建金線蓮“活性成分-主要靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，由Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，得到其主要活性成分和核心靶點。該網(wǎng)絡(luò)中有103個節(jié)點(24個金線蓮主要活性成分、56個主要靶點、23種信號通路)和440條邊。綜合參考了網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)選出排名前10的金線蓮主要活性成分的核心靶點(表3)，“活性成分-主要靶點-通路”見圖3。

紅色圓形節(jié)點()代表活性成分，黃色方形節(jié)點()代表靶點，綠色菱形節(jié)點()代表通路。

表3 金線蓮主要活性成分的核心靶點

網(wǎng)絡(luò)中連接度排名前10的活性成分為：α-亞麻酸、3′,4′,7-三甲氧基-3,5-二羥基黃酮、棕櫚酸、鼠李秦素、2-十二烷酮、槲皮素、5,4′二羥基-6,7,3′-三甲氧基黃酮、異鼠李素、鄰苯二甲酸二丁酯、芹菜素。連接度排名前10的通路為：Pathways in cancer(癌癥相關(guān)通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信號通路)、Proteoglycans in cancer(腫瘤中蛋白多糖相關(guān)通路)、Focal adhesion(黏著斑信號通路)、Ras signaling pathway(Ras信號通路)、Rap1 signaling pathway(Rap1信號通路)、Insulin resistance(胰島素抵抗相關(guān)通路)、Hepatitis C(C型肝炎相關(guān)通路)、Thyroidhormone signaling pathway(甲狀腺素信號通路)及Viral carcinogenesis(病毒致癌相關(guān)通路)。

2.6 相關(guān)疾病的獲取 10個核心靶點通過CTD數(shù)據(jù)庫匹配后，篩選出已有實驗驗證的結(jié)果，共得到154種相關(guān)疾病。將各靶點與其相關(guān)疾病構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)。

黃色圓形()代表核心靶點，綠色方形節(jié)點()代表疾病。

在該網(wǎng)絡(luò)中，一共有164個節(jié)點(10個核心靶點、154種疾病)和241條邊，與核心靶點相關(guān)的疾病主要集中在腫瘤，包括乳腺、前列腺、肺、卵巢等部位的腫瘤，選取網(wǎng)絡(luò)中連接度排名前20的疾病，即乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、肺腫瘤、腫瘤浸潤、心肌病、肝外膽汁淤積、鱗狀細胞癌、卵巢腫瘤、腫瘤性細胞轉(zhuǎn)化、結(jié)腸腫瘤、直腸腫瘤、2型糖尿病、皮膚腫瘤、心臟肥大、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥 、頭頸部腫瘤、胃腫瘤、腦缺血、腫瘤轉(zhuǎn)移。

3 討 論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學，通過研究活性成分作用的靶點、靶點所參與人體生物學過程及其所調(diào)節(jié)的人體通路，計算PPI網(wǎng)絡(luò)、有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)、核心靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的度值，挖掘出核心的作用靶點及主治疾病，進而探討金線蓮藥理作用的分子機制。

研究結(jié)果顯示，控制癌癥的發(fā)生和發(fā)展是金線蓮最主要的功效。通路富集分析結(jié)果表明，在金線蓮的56個主要靶點中，有33個(其中8個核心靶點)參與癌癥相關(guān)通路的調(diào)控。富集程度最高、最顯著的通路是PI3K-Akt信號通路(靶點富集數(shù)目23個，P<0.01)，核心靶點表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)位于PI3K-Akt信號通路的上游，其高表達或者突變能夠為腫瘤細胞的生長和生存創(chuàng)造有利條件[14]，活化后的EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域能夠激活PI3K，繼而參與對 PI3K-Akt 信號通路的調(diào)控[15]，最終導(dǎo)致細胞逃避正常的凋亡過程。根據(jù)分子對接結(jié)果顯示，金線蓮中3′,4′,7-三甲氧基-3,5-二羥基黃酮、異鼠李素、芹菜素、槲皮素、5,4′二羥基-6,7,3′-三甲氧基黃酮與EGRF具有較強的結(jié)合活性。已有相關(guān)研究表明，異鼠李素能減少癌細胞蛋白磷酸化程度，有效調(diào)節(jié)EGFR的活動，抑制皮膚癌細胞的增殖[16]；槲皮素可下調(diào)EGFR的表達，抑制人乳腺癌細胞株T47D的增殖[17]；芹菜素與ABT-263(小分子Bcl-2抑制劑)聯(lián)合使用能夠抑制EGFR突變腫瘤細胞的生長、促進凋亡[18]。因此，推測金線蓮治療腫瘤的主要機制之一：通過異鼠李素、槲皮素、芹菜素等活性成分直接與EGFR相結(jié)合，抑制其高度表達或突變，從而引起下游信號通路的級聯(lián)放大反應(yīng)，進而調(diào)控腫瘤細胞的生長。

除治療癌癥外，金線蓮在降低血糖、血脂以及血壓方面也具有明顯的功效。本研究結(jié)果顯示，共13個主要靶點(其中4個核心靶點)參與對胰島素抵抗相關(guān)通路的調(diào)控，胰島素抵抗是2型糖尿病等多種代謝疾病的重要根源，它與高血壓病、高血脂等相互影響且互為因果[19]。分子對接結(jié)果顯示，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)作為核心靶點，與鼠李秦素、山奈酚、芹菜素等活性成分具有較強的結(jié)合活性。GSK-3β的過度表達，使胰島素受體上的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化，下調(diào)胰島素受體的表達水平，削弱胰島素信號傳導(dǎo)通路[20]。在骨骼肌中，通過抑制GSK-3β的活性可以解除AKT2對糖原合酶活性的抑制，促進肌糖原的合成，從而降低血糖[21]。研究表明，芹菜素和山奈酚都具有改善胰島素抵抗的功能[22-23]。因此，推測芹菜素和山奈酚可直接作用于靶點GSK-3β，繼而引發(fā)胰島素受體后的一系列變化。但二者是否通過直接作用抑制GSK-3β的活性，繼而促進糖原的合成，則需要進一步的實驗驗證。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學的角度，進一步驗證了金線蓮在腫瘤、高血糖、高血脂、高血壓以及心血管疾病和肝臟損傷的治療中具有一定的功效，初步探究了金線蓮的核心靶點EGFR、GSK-3β的分子作用機制。該方法對于傳統(tǒng)中藥以及外來藥材的功能定位研究具有一定的借鑒作用。但本研究的結(jié)果是基于數(shù)據(jù)庫的檢索和計算機的模擬及篩選，對于靶點的作用機制尚需進一步實驗進行驗證。