張婕 汪露 韓世愈

宮頸癌(cervical cancer，CESC)屬于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率較高，對(duì)女性生命和健康存在極大威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)病例約53萬(wàn)人，死亡人數(shù)高達(dá)27萬(wàn)人[1]。臨床統(tǒng)計(jì)資料顯示，80%以上有夫妻生活經(jīng)歷的女性存在程度不等的宮頸疾病困擾，而處于17歲～28歲階段的女性更易患宮頸疾病，一些女性未及30歲即發(fā)生了早期宮頸病變，有的甚至出現(xiàn)晚期宮頸病變，在發(fā)病年齡方面相較于以往提早了近十年[2]。在惡性腫瘤的遷移與侵襲活動(dòng)中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)發(fā)揮著關(guān)鍵性影響。腫瘤的形成與發(fā)展過(guò)程涉及諸多基因以及步驟，其中EMT對(duì)于源于上皮的惡性腫瘤遷移與侵襲行為發(fā)揮著關(guān)鍵性影響[3]。EMT，即在一定生理與病理環(huán)境中上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞的行為。此行為發(fā)生期間，上皮細(xì)胞的細(xì)胞極性、細(xì)胞間的黏附性逐漸喪失，游走性能與侵入能力顯著提升[4]。叉頭框C1蛋白 (forkhead box protein C1， FOXC1)是一種新型轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示，F(xiàn)OXC1在惡性腫瘤發(fā)病、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，例如，在鼻咽癌中檢測(cè)到FOXC1的高表達(dá)，而FOXC1通過(guò)上調(diào)波形蛋白、纖維連接蛋白和N-cadherin的表達(dá)[5]，在EMT中起到關(guān)鍵作用。FOXC1在乳腺癌中是EGFR功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，目前已發(fā)現(xiàn)FOXC1的顯著上調(diào)可通過(guò)激活Hedgehog信號(hào)通路來(lái)調(diào)控癌癥干細(xì)胞特性的豐富[6]。在肝細(xì)胞癌中，F(xiàn)OXC1通過(guò)調(diào)節(jié)EMT參與微血管浸潤(rùn)[7]。有報(bào)道表明，F(xiàn)OXC1的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，包括乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌[8-11]。然而，F(xiàn)OXC1的表達(dá)及其在宮頸癌中的潛在作用尚不清楚。本研究旨在探討沉默F(xiàn)OXC1的宮頸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料及方法

一、材料

正常宮頸細(xì)胞NC104與人宮頸癌 CaSki、ME-180、HeLa細(xì)胞購(gòu)于中科院上海腫瘤研究所，細(xì)胞均用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。引物設(shè)計(jì)后由上海生工合成，LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于漢恒生物，pLKO.1-shFOXC1(本實(shí)驗(yàn)室克隆)。β-catenin抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體購(gòu)于美國(guó)Affinty 公司，TRANSWELL小室及Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于corning公司。DMEM培養(yǎng)基和小牛血清購(gòu)自Gibco公司。

二、四種細(xì)胞中FOXC1mRNA及蛋白水平表達(dá)

1.細(xì)胞總RNA用TRIzol試劑盒提?。篟T-PCR 95℃ 30 s，95℃ 5 s 40個(gè)循環(huán)，60℃ 30 s。引物序列如下。

FOXC1:

5′-CTG CCC GAC TAC TCT CTG C-3′

5′-CAC CGA GTG GAA GTT CTG C-3′;

GAPDH:

5′-CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA-3′

5′-TTC ACA CCC ATG ACG AAC AT-3′。

采用2-ΔΔCT法計(jì)算FOXC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.Western Blot檢測(cè)四種宮頸癌細(xì)胞中FOXC1基因的表達(dá)：FOXC1蛋白表達(dá)采用Western blot法。收集四組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解充分約30 min，提取總蛋白，進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)并制備蛋白樣品。SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5% BSA搖床室溫封閉1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min。加入FOXC1(1∶1 000)和內(nèi)參GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST洗滌3次，每次15 min;加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min；ECL顯影、曝光。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計(jì)算FOXC1蛋白相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)RT-PCR及Western blot檢測(cè)宮頸癌HeLa細(xì)胞中FOXC1表達(dá)量較高。

三、基因轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/mL，6孔板中每孔2 mL細(xì)胞懸液接種，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞狀態(tài)良好且融合度達(dá)60%～80%時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為3組。 (1)對(duì)照組:轉(zhuǎn)染陰性的Hela細(xì)胞; (2)陰性對(duì)照組:用pc DNA3.1 (+) -neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞; (3) 轉(zhuǎn)染特異性siRNA組:用pLKO.1-shFOXC1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行培養(yǎng)， 3 d后嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞連代培養(yǎng)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR及Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FOXC1mRNA及蛋白表達(dá)，達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、Transwell小室遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

1.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力：制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL。取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell上室， 下室中加入500 μL的DMEM培養(yǎng)液，小心消除基質(zhì)膠與培養(yǎng)液間的氣泡。48 h后進(jìn)行取樣，吸凈chamber上室內(nèi)液體，無(wú)菌鑷子取出chamber，移至800 μL甲醇溶液內(nèi)，室溫固定30 min。從甲醇溶液中取出chamber，吸干甲醇溶液，移至800 μL Giemsa染色液中，室溫染色30 min，后用去離子水沖洗后吸干液體，濕棉棒擦去chamber上室未遷移細(xì)胞，PBS沖洗3遍。倒置顯微鏡下隨機(jī)取9視野，并記數(shù)。

2.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力：用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室基底膜，Matrigel膠4℃過(guò)夜融化備用，用4℃預(yù)冷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基1∶3稀釋Matrigel至終濃度為1 mg/mL，冰上操作;滅菌槍頭包被小室的底部,37℃靜置1 h，使其干成膠狀。其余方法同遷移實(shí)驗(yàn)，并記數(shù)。

五、檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后β-catenin、Vimentin及E-cadherin蛋白表達(dá)

收集三組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組包括空白對(duì)照組(HeLa)、空載組(GFP- HeLa)、HeLa-FOXC1(-)組，分別提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè) β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)差異，參照二-2中采用Western blot法檢測(cè)β-catenin、Vimentin及E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPPS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用表示，采用單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、四種細(xì)胞中FOXC1 mRNA及蛋白表達(dá)

應(yīng)用PCR及Western Blot方法檢測(cè)正常宮頸細(xì)胞NC104及宮頸癌 CaSki、ME-180、HeLa細(xì)胞株中FOXC1表達(dá)。PCR及Western Blot結(jié)果提示宮頸癌HeLa細(xì)胞中FOXC1高表達(dá)。

二、慢病毒轉(zhuǎn)染及篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FOXC1細(xì)胞

1.以MOI=30 慢病毒感染HeLa細(xì)胞系，48 h后熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)圖2。并以嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)FOXC1 shRNA的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選計(jì)數(shù)，其平均熒光細(xì)胞比率為(93.71±0.26)%。

圖1 RT-PCR檢測(cè)四組細(xì)胞中FOXC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及Western Blot檢測(cè)四組細(xì)胞中FOXC1表達(dá)情況Figure 1 The relative expression of FOXC1 mRNA detected by RT-PCR and the expression of FOXC1 protein detected by Western blot

2.轉(zhuǎn)染48 h后，PCR檢測(cè)FOXC1mRNA的表達(dá)情況：各種的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表1，其中轉(zhuǎn)染FOXC1特異性shRNA組與陰性對(duì)照組、對(duì)照組相比較，F(xiàn)OXC1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 FOXC1基因在各組中的表達(dá)情況Table 1 The expression of FOXC1 gene in three groups of

A: Observation results of ordinary light microscope； B: Observation results of green fluorescence microscope；C: Fusion diagram of A and B圖2 熒光顯微鏡下觀察HeLa-FOXC1(-)細(xì)胞系(放大倍數(shù)，×10倍)的熒光顯示轉(zhuǎn)染情況Figure 2 The transfection of -FOXC1 (-) cell line was observed under fluorescence microscope (magnification, ×10)

3.轉(zhuǎn)染48 h后Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞中FOXC1蛋白水平表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后分別提取感染陰性組細(xì)胞HeLa、感染空載體組細(xì)胞HeLa-GFP以及感染FOXC1 shRNA組細(xì)胞HeLaFOXC1(-)的總蛋白，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)三種細(xì)胞中FOXC1蛋白的表達(dá)差異，GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果可見(jiàn)HeLa-FOXC1(-)組細(xì)胞內(nèi)FOXC1蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 三組細(xì)胞中FOXC1蛋白相對(duì)表達(dá)情況Figure 3 The relative expression of FOXC1 protein in three groups

三、3組細(xì)胞Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.使用Transwell小室24 h后檢測(cè)HeLa細(xì)胞系，GFP穩(wěn)定株和FOXC1的干擾穩(wěn)定株的細(xì)胞遷移情況：遷移結(jié)果顯示，敲減FOXC1基因后三組細(xì)胞遷移能力比較， HeLa-FOXC1(-)組細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.05)，HeLa組與 HeLa-GFP組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖4。

圖4 Transwell小室24 h后三組細(xì)胞遷移情況(×40)Figure 4 Cell migration of crystal violet staining of shFOXC1 and control group cells that crossed the polycarbonate membrane of the Transwell chamber (×40)

2.用Transwell小室24 h時(shí)分別檢測(cè)HeLa細(xì)胞系，GFP穩(wěn)定株和FOXC1的干擾穩(wěn)定株的細(xì)胞侵襲情況：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減FOXC1基因后三組細(xì)胞侵襲能力比較， HeLa-FOXC1(-)組細(xì)胞侵襲能力明顯下降(P<0.05)，HeLa組與 HeLa-GFP組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖5。

圖5 Transwell小室24 h后三組細(xì)胞侵襲情況(×40)Figure 5 Cell invasion of crystal violet staining of the shFOXC1 and control group cells that crossed the Matrigel-coated polycarbonate membrane of the Transwell chamber to (×40)

四、Western blot檢測(cè)感染前后各組細(xì)胞 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)情況

由圖6所示，A:使用WB法檢測(cè)HeLa細(xì)胞系，GFP穩(wěn)定株和FOXC1的干擾穩(wěn)定株中E-cadherin,β-catenin和vimentin的蛋白表達(dá)情況；B：使用WB法檢測(cè)HeLa細(xì)胞系，GFP穩(wěn)定株和FOXC1的干擾穩(wěn)定株中E-cadherin的蛋白表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果(P<0.05)；C：使用WB法檢測(cè)HeLa細(xì)胞系，GFP穩(wěn)定株和FOXC1的干擾穩(wěn)定株中β-catenin的蛋白表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果(P<0.05)；D：使用WB法檢測(cè)HeLa細(xì)胞系，GFP穩(wěn)定株和FOXC1的干擾穩(wěn)定株中vimentin的蛋白表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果(P<0.05)。結(jié)果可見(jiàn)，HeLa-FOXC1(-)組細(xì)胞內(nèi)β-catenin及Vimentin蛋白的表達(dá)明顯降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)有增高。

圖6 Western blot檢測(cè)感染前后各組細(xì)胞中 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)情況及各組細(xì)胞中蛋白的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 The expression of protein and the relative expression quantity ofβ-catenin, E-Cadhenrin and Vimentin detected by Western blot

討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤臨床治療的難題及腫瘤患者死亡的主要原因。惡性腫瘤中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變現(xiàn)象的發(fā)生是引起腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。EMT出現(xiàn)的分子標(biāo)志為N-cadherin、Fibronectin與Vimentin這3類間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的提升，β-Catenin與E-cadherin這2類上皮標(biāo)志物表達(dá)的缺失或降低[12-14]。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1基因在宮頸癌患者的臨床病理中高表達(dá)，且隨著期別進(jìn)展，F(xiàn)OXC1基因的表達(dá)有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究主要通過(guò)慢病毒RNA干擾技術(shù)，敲減宮頸癌HeLa細(xì)胞中FOXC1基因的表達(dá)，并通過(guò)倒置熒光顯微鏡及PCR、Western Blot方法驗(yàn)證在HeLa-FOXC1(-)細(xì)胞中，F(xiàn)OXC1基因的mRNA及蛋白水平明顯降低，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得穩(wěn)定沉默F(xiàn)OXC1的細(xì)胞系，通過(guò)Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，感染FOXC1-shRNA組細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯降低，進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞中β-catenin、E-cadherin及Vimentin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOXC1敲除組細(xì)胞系內(nèi)β-catenin及Vimentin蛋白的表達(dá)明顯降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)有增高，進(jìn)一步驗(yàn)證敲除FOXC1基因的宮頸癌細(xì)胞后，下調(diào)上皮-間轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中與轉(zhuǎn)移有關(guān)蛋白(β-catenin、Vimentin)的表達(dá)，并增加鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)，使其侵襲及轉(zhuǎn)移能力隨之下降。由此可見(jiàn)，F(xiàn)OXC1和EMT在宮頸癌發(fā)展過(guò)程中有一定作用，其異常表達(dá)可能作為宮頸癌檢查新的標(biāo)志物。

宮頸癌是女性非常常見(jiàn)的婦科癌癥之一，現(xiàn)全世界范圍內(nèi)每年仍有超過(guò)30萬(wàn)人因此病死亡[2]，當(dāng)前形勢(shì)下其具體病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確。臨床上，宮頸癌的進(jìn)展是從局部浸潤(rùn)、侵犯周?chē)鞴偌傲馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其特點(diǎn)是早期可發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者5年生存率為82.3%，有淋巴轉(zhuǎn)移的5年生存率為50.8%[15]。因此，控制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是提高宮頸癌患者生存率的主要方法之一[16-17]。腫瘤的基因靶向治療是未來(lái)癌癥治療的主要手段，在不久的將來(lái)，相信FOXC1有望成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。