洪盛威，夏澤遠(yuǎn)，陳 恒，王 皓

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210008；2 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 藥學(xué)部，南京210008

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床常見的癌癥類型，其在全球的發(fā)病率與致死率均逐年升高。我國(guó)CRC 的發(fā)病率為284.55/10 萬，死亡率為176.28/10 萬[1]。目前其主要治療手段是手術(shù)、化療及放療相結(jié)合的綜合治療，由于放化療技術(shù)具有副作用明顯、局部選擇性差的缺點(diǎn)，故對(duì)藥物治療方法進(jìn)行研究仍屬熱點(diǎn)。

現(xiàn)代腫瘤靶向制劑具有選擇性高、作用效應(yīng)好的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于特定腫瘤的臨床治療中。中醫(yī)歸經(jīng)理論表明，藥物作用于機(jī)體有相對(duì)的趨向性，可發(fā)揮引導(dǎo)效應(yīng)?，F(xiàn)代藥理研究表明，中藥歸經(jīng)理論與現(xiàn)代腫瘤靶向制劑研究觀點(diǎn)極為相似[2]。能否利用歸經(jīng)理論縮小抗CRC 藥物的篩選范圍，尋找具有抗CRC 作用的中藥單體，值得深入研究探討。

得益于X 衍射等相關(guān)解析技術(shù)的進(jìn)步，CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)逐步明晰，此類靶點(diǎn)受體結(jié)構(gòu)的分子藥物設(shè)計(jì)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究得以迅速發(fā)展[3]。通過三維空間結(jié)構(gòu)及能量匹配可預(yù)測(cè)藥物（配體）和受體之間潛在的結(jié)合模式及結(jié)合力，探討藥物和靶點(diǎn)間作用效應(yīng)機(jī)制。該方法降低了篩選活性成分的盲目性，縮短了篩選時(shí)間，降低了研發(fā)成本，為快速篩選中藥潛在活性成分提供借鑒。

本實(shí)驗(yàn)基于CRC 發(fā)病機(jī)理[4]，針對(duì)性地選擇歸大腸經(jīng)中藥，從相關(guān)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘，構(gòu)建該類中藥的單體數(shù)據(jù)庫；同時(shí)確定CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，借助于系統(tǒng)虛擬藥理學(xué)方法探討歸大腸經(jīng)中藥單體與CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合效應(yīng)，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病” 作用效應(yīng)圖，并結(jié)合CCK-8 與Western blot 進(jìn)行體外驗(yàn)證，為篩選中藥潛在活性成分提供參考。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

黃連堿（批號(hào)MUST-17072010）、大黃酸（批號(hào)MUST-18031309）、蘆薈大黃素（批號(hào)MUST-18032605）、大黃素（批號(hào)MUST-17102702）、楊梅素（批號(hào)MUST-18021524）、苦杏仁苷（批號(hào)MUST-18042810）均購自成都曼思特生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)液（批號(hào)323050011），胎牛血清（批號(hào)085150010），青霉素、鏈霉素（批號(hào)450201008）均購自維森特生物技術(shù)南京有限公司；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)67057313）Biosharp 公司；GAPDH 兔IgG（批號(hào)0019），VEGFR2 兔IgG（批號(hào)0002）均購自美國(guó)CST 中國(guó)分公司；MMP-9 兔IgG（美國(guó)Cell Signal公司，批號(hào)11927S）；蛋白預(yù)染Marker（Thermo，批號(hào)00261899）；其他試劑均為分析純；水為純化水。

1.2 儀器

DMI3000B 倒置光學(xué)顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）；MICRO-17R 冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；AE240 電子天平（美國(guó)梅特勒-托利多公司）；ELx800 酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；EPS300電泳電源，VE-180 垂直電泳槽，5300 凝膠成像系統(tǒng)（均為上海天能科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 細(xì)胞購自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.4 中藥單體的分子特征計(jì)算及計(jì)算機(jī)輔助篩選

分子特性計(jì)算基于Canvas 平臺(tái)。計(jì)算機(jī)輔助篩選程序及軟件為Maestro 藥物設(shè)計(jì)平臺(tái)，包括中藥活性組分?jǐn)?shù)據(jù)庫中小分子前處理優(yōu)化模塊Macro-Model；活性組分基于靶點(diǎn)計(jì)算機(jī)輔助篩選模塊Glide；蛋白三維結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、評(píng)測(cè)模塊同源模建Prime，用于蛋白靶點(diǎn)活性位點(diǎn)結(jié)合口袋搜尋及確證模塊SiteMap。以上平臺(tái)均來源于Schr?dinger 公司。CRC 靶點(diǎn)選自GeneGo 公司系統(tǒng)虛擬藥理學(xué)平臺(tái)MetaDrug。

2 方 法

2.1 歸大腸經(jīng)中藥單體數(shù)據(jù)庫

收集常用中藥[5]，獲得大黃、烏梅、甘遂等歸大腸經(jīng)中藥共85 味。基于傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）、中國(guó)中藥整合數(shù)據(jù)庫（TCMID），并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘，收集上述85 味歸大腸經(jīng)中藥所含中藥單體2925 個(gè)。從Pubchem 數(shù)據(jù)庫中獲得上述中藥單體的分子結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子量、分子式等信息，建立歸大腸經(jīng)中藥單體數(shù)據(jù)庫。之后，使用MacroModel[6]模塊對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行處理，選擇OPLS_2005 力場(chǎng)和TNCG 進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，優(yōu)化時(shí)能量閾值設(shè)定為0.5 kJ·nm-1·mol-1，目的是使均方根偏差（RMSD）變化盡可能小[7]。

2.2 CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的選擇

對(duì)CRC 相關(guān)信號(hào)通路領(lǐng)域的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行歸納總結(jié)[8]。采用GeneGo 公司MetaDrug 模塊，選擇CRC 靶點(diǎn)。通過對(duì)靶點(diǎn)相關(guān)的配體、蛋白信息的判別，最終確定了10 個(gè)與CRC 疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.3 中藥單體分子特性計(jì)算及計(jì)算機(jī)輔助篩選

將2925 個(gè)歸大腸經(jīng)中藥單體裝載到Schr?dinger（2018）平臺(tái)的Canvas 模塊，對(duì)9 個(gè)關(guān)鍵分子描述符進(jìn)行計(jì)算，包括原子的LogP、電拓?fù)錉顟B(tài)、氫鍵受體數(shù)、氫鍵供體數(shù)、摩爾折射率、分子量、極性表面積、Miller 極化值、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)，涉及物理化學(xué)、拓?fù)涞榷鄠€(gè)方面的信息。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道，確定CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)，其蛋白結(jié)構(gòu)均從RSCD PDB 數(shù)據(jù)庫獲取，選用Maestro 藥物設(shè)計(jì)平臺(tái)的計(jì)算機(jī)輔助篩選模塊Glide；本研究的篩選程序如下：將每個(gè)CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入平臺(tái)，進(jìn)行加氫原子、去除水分子、處理重原子、調(diào)整鍵序等前處理，選用OPLS_2005 力場(chǎng)進(jìn)行能量最小化優(yōu)化處理，直到非氫原子的均平方根偏差（root-meansquare deviation，RMSD）減小為3 nm。接著，采用Glide 對(duì)接模塊下receptor grid generation 面板產(chǎn)生活性位點(diǎn)結(jié)合口袋，以各個(gè)蛋白自帶配體為中心、生成活性格點(diǎn)盒子；其中蛋白和配體間范圍設(shè)置為1.0/0.8；精度方面選擇標(biāo)準(zhǔn)精度，每個(gè)配體均對(duì)接10 次，最后取總平均值，進(jìn)行歸大腸經(jīng)的中藥單體基于CRC 靶點(diǎn)的計(jì)算機(jī)輔助篩選研究。最后，記錄輔助篩選評(píng)價(jià)打分指標(biāo)如對(duì)接得分、范德華力、結(jié)合能、氫鍵指標(biāo)等，并按照總對(duì)接得分從高到低依次排序，以評(píng)價(jià)各中藥單體與CRC 靶點(diǎn)間的結(jié)合效應(yīng)。

2.4 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

依據(jù)計(jì)算機(jī)輔助篩選結(jié)果，以CRC 靶點(diǎn)蛋白自帶配體的對(duì)接評(píng)分為閾值，得分高于閾值的中藥單體即判定具有活性，選取前30 個(gè)成分與相應(yīng)的靶蛋白導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 網(wǎng)絡(luò)分析軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，其中單體、靶點(diǎn)、疾病用節(jié)點(diǎn)表示，三者間的相互關(guān)系用邊表示，最后選用Cytoscape3.7.1 的Network Analyzer 插件分析“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)特征。

2.5 HCT116 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

復(fù)蘇HCT116 細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%亞融合狀態(tài)時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，PBS 蕩洗2 次，胰酶消化，棄消化液，PBS 蕩洗2 次，加適量含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液，吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞，分成4 瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。用4～6 代HCT116 細(xì)胞、生長(zhǎng)融合后，胰蛋白酶消化、吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組為：對(duì)照組、給藥組（50 μg·mL-1）。藥物用DMEM 培養(yǎng)液稀釋，進(jìn)行藥物干預(yù)前，棄去原培養(yǎng)液。

2.6 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性

借助CCK-8 法檢測(cè)篩選出的前6 個(gè)中藥單體對(duì)HCT116 細(xì)胞活性的影響。懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，之后用DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，并將密度調(diào)整至1×105個(gè)·mL-1，將該濃度的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)置10 個(gè)復(fù)孔，共7 組，24 h細(xì)胞孵育貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，各組加入對(duì)應(yīng)藥物100 μL，對(duì)照組加入DMEM 培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)24 h，之后每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（OD）。將對(duì)照組細(xì)胞存活率定義為100%，細(xì)胞活性按公式計(jì)算：細(xì)胞活性=（試驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）l00%。

2.7 Western blot 檢測(cè)VEGFR2、MMP-9 蛋白水平

為證明篩選策略的可靠性、準(zhǔn)確性，本研究選取VEGFR2、MMP-9 進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 證，研究篩選結(jié)果中前6 個(gè)中藥單體對(duì)HCT116 細(xì)胞VEGFR2、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)懸浮細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，并將密度調(diào)整至2.5×105個(gè)·mL-1，將該濃度的細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，共7 組，24 h 細(xì)胞孵育貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，各組加入對(duì)應(yīng)藥物2 mL，對(duì)照組加入DMEM 培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)24 h 后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集各組細(xì)胞至新的EP 管內(nèi)。Western blot 裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，Bradford 法進(jìn)行蛋白定量。加入上樣緩沖液并煮沸蛋白10 min，取50 μg 總蛋白作SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，按照分子量的大小將PVDF 膜剪開，使內(nèi)參GAPDH 與目的基因分開，之后分別孵育GAPDH（1∶5000）、VEGFR2（1∶1000）、MMP-9（1∶500）抗體，4 ℃孵育過夜，以TBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min，之后以對(duì)應(yīng)的二抗（1∶10000）孵育2 h，以TBST 清洗PVDF 膜3次，每次10 min，采用凝膠成像系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western blot 數(shù)據(jù)采用Quatity one 軟件進(jìn)行灰度值的統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行方差分析并作圖。多組間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)。P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 歸大腸經(jīng)中藥單體的分子特征

采用Canvas 模塊對(duì)歸大腸經(jīng)的中藥單體分子描述符進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)量眾多，結(jié)構(gòu)類型各異。本研究共研究了85 味中藥中共計(jì)2925 個(gè)單體，表1 顯示，統(tǒng)計(jì)的描述符數(shù)據(jù)中極性表面積等指標(biāo)SD 與均數(shù)相近，甚至大于均數(shù)，離散度大。該統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的歸大腸經(jīng)的中藥單體數(shù)據(jù)庫具有較好的結(jié)構(gòu)多樣性分子特征。

表1 歸大腸經(jīng)中藥單體的關(guān)鍵描述符特征

3.2 靶點(diǎn)選擇

通過對(duì)CRC 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)研究分析，確證了10 個(gè)CRC 類疾病相關(guān)的作用靶點(diǎn)，分別為：基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TTHY）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、血小板源性生長(zhǎng)因子受體α（PDGFRα）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4（FGFR4）、酪氨酸蛋白激酶ABL1（ABL1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），詳細(xì)信息見表2，并在此基礎(chǔ)上考察中藥單體與CRC 靶點(diǎn)間的作用效應(yīng)。

表2 CRC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)

3.3 與蛋白多靶點(diǎn)作用效果較好小分子化學(xué)結(jié)構(gòu)

本研究篩選了2925 個(gè)中藥單體與10 個(gè)CRC相關(guān)靶點(diǎn)之間的結(jié)合效應(yīng)，限于篇幅，未能將每個(gè)單體與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)效應(yīng)一一列出，僅選出與4個(gè)及以上靶點(diǎn)有作用效應(yīng)的中藥單體，共計(jì)30 個(gè)，見圖1。篩選出的中藥單體從結(jié)構(gòu)上屬于黃酮類、香豆素類、蒽醌類、木脂素類、苯甲酸類、糖苷類、酚類、脂肪酸類、生物堿類等化合物。對(duì)85 個(gè)歸大腸經(jīng)中藥與30 個(gè)分子的相關(guān)性進(jìn)行分析，排名前5的中藥分別為：老鸛草（7/30）、馬齒莧（6/30）、敗醬草（6/30）、澤漆（6/30）、委陵菜（6/30），其中有7 個(gè)中藥單體來自老鸛草，占較大權(quán)重（7/30），分別為（5）楊梅素、（11）鞣花酸、（17）金絲桃苷、（24）槲皮素、（25）蘆丁、（26）山奈酚、（29）木犀草素。

圖1 篩選出的前30 個(gè)中藥單體的分子結(jié)構(gòu)信息

表3 列舉了與4 個(gè)及以上CRC 靶點(diǎn)存在較好結(jié)合效應(yīng)的30 個(gè)中藥單體，包括：（1）黃連堿、（2）大黃酸、（3）蘆薈大黃素、（4）大黃素、（5）楊梅素、（6）苦杏仁苷、（7）千層紙素A、（8）咖啡酸、（9）巴豆酸、（10）大黃酚、（11）鞣花酸、（12）漢黃芩素、（13）丁香酸、（14）瑞枯靈、（15）辛夷脂素、（16）小檗堿、（17）金絲桃苷、（18）檜黃素、（19）丁香酚、（20）香豆素、（21）芹菜素、（22）香葉木素、（23）蒙花苷、（24）槲皮素、（25）蘆丁、（26）山奈酚、（27）芫花素、（28）異鼠李素、（29）木犀草素、（30）大黃素甲醚。

表3 前30 個(gè)與CRC 靶點(diǎn)結(jié)合效應(yīng)較好中藥單體的多靶點(diǎn)效應(yīng)

3.4 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)

以“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)層次分析可以提供生物網(wǎng)絡(luò)的一般特征，亦可計(jì)算節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)特征，此方法有助于從復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)中獲得潛在的生物信息。如圖2 所示，“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)表明，中藥既存在單個(gè)成分與多個(gè)靶點(diǎn)的相互作用，同時(shí)也存在不同成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，該結(jié)果初步闡明了中藥多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。通過Network Analyzer 插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)模型的重要參數(shù)，常見的網(wǎng)絡(luò)參數(shù)有節(jié)點(diǎn)數(shù)（number of nodes）、網(wǎng)絡(luò)密度（network density）、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性（network heterogeneity）、網(wǎng)絡(luò)中心度（network centralization）等[9]。網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：直徑為3，半徑為2，中心度為0.530，密度為0.240，節(jié)點(diǎn)數(shù)為41，異質(zhì)性為0.718。

圖2 中藥抗CRC“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)特征效應(yīng)圖

3.5 篩選出的前6 個(gè)中藥單體對(duì)HCT116 細(xì)胞活性的影響

由CCK-8 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予黃連堿、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、楊梅素、苦杏仁苷（50 μg·mL-1）后，各組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05），說明通過計(jì)算機(jī)輔助篩選出的前6 個(gè)中藥單體對(duì)HCT116 細(xì)胞活性具有一定的抑制作用，其細(xì)胞活性（相比對(duì)照組）分別為100.00±6.23、69.11±8.12、82.33 ±5.23、75.23 ±6.25、78.55 ±4.63、71.66 ±6.65、83.79±7.78。

3.6 篩選出的前6 個(gè)中藥單體對(duì)HCT116 細(xì)胞VEGFR2、MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，黃連堿、大黃素、楊梅素、苦杏仁苷組HCT116 細(xì)胞中VEGFR2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；大黃酸組HCT116 細(xì)胞中VEGFR2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；蘆薈大黃素組HCT116 細(xì)胞中MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），該結(jié)果表明，黃連堿、大黃素、楊梅素、苦杏仁苷可以同時(shí)抑制HCT116 細(xì)胞中MMP-9 和VEGFR2 蛋白的表達(dá)；大黃酸可以抑制HCT116 細(xì)胞中VEGFR2 蛋白的表達(dá)，蘆薈大黃素可以抑制HCT116 細(xì)胞中MMP-9 蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖3。以上結(jié)果與計(jì)算機(jī)輔助篩選結(jié)果完全一致，這在一定程度上驗(yàn)證了本策略的可靠性、準(zhǔn)確性。

圖3 HCT116 細(xì)胞中VEGFR2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平

4 討論

臨床上多數(shù)疾病的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，涉及多基因、多靶點(diǎn)通路和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。西藥的開發(fā)基本是基于“一藥物、一靶點(diǎn)、一疾病”的研發(fā)模式，該方法看重藥物與靶點(diǎn)之間作用的特異性而忽略了人體各系統(tǒng)之間的平衡關(guān)系。雖然一些針對(duì)腫瘤分子遺傳學(xué)改變開發(fā)的抗腫瘤新藥已在臨床使用，并顯示出良好的臨床應(yīng)用前景；但其只針對(duì)部分特定類型的腫瘤患者才能發(fā)揮療效，并存在一定的不良反應(yīng)。中藥是中醫(yī)防病治病的主要手段，是天然組合化學(xué)庫，化合物數(shù)量巨大。大量文獻(xiàn)報(bào)道表明，許多中藥復(fù)方、單味中藥在CRC 治療方面可發(fā)揮明顯作用，同時(shí)具有副作用小、易于取材的優(yōu)點(diǎn)[10]；但其作用機(jī)制及活性成分不明確的問題成為開發(fā)中藥新藥的瓶頸，如何從中藥中篩選出活性成分對(duì)于中藥的發(fā)展至關(guān)重要。

歸經(jīng)是指中藥對(duì)某臟腑經(jīng)絡(luò)的選擇特性，是中藥藥性理論的重要組成部分，中醫(yī)歸經(jīng)理論的運(yùn)用是中醫(yī)學(xué)的特色之一，其實(shí)質(zhì)是宏觀的靶向思維。在中醫(yī)藥腫瘤治療的臨床實(shí)踐中，已有學(xué)者總結(jié)了歸經(jīng)理論用于腫瘤中藥治療的經(jīng)驗(yàn)，如腦腫瘤用蟲類藥僵蠶、全蝎；食管癌用硼砂、硇砂；甲狀腺癌用白芥子、僵蠶；肺癌用桔梗、白果；胃癌用半枝蓮、白術(shù)；肝癌用柴胡、青皮、陳皮；直腸癌用苦參等[11]。從歸大腸經(jīng)中藥中尋找抗CRC 有效成分，可有效縮小抗癌藥物的篩選范圍，提高篩選的靶向性。系統(tǒng)虛擬藥理學(xué)是利用分子對(duì)接技術(shù)研究小分子配體與生物大分子受體間的相互作用，預(yù)測(cè)其結(jié)合模式，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)?；谂潴w與受體作用的鎖匙原理，分子對(duì)接可較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)與靶受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物，目前已在天然藥物開發(fā)中被廣泛使用。將系統(tǒng)虛擬藥理學(xué)與歸經(jīng)理論用于中藥新藥的開發(fā)，探索一種中醫(yī)歸經(jīng)理論指導(dǎo)下的，快速篩選中藥活性成分的方法，對(duì)于研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及闡明其作用機(jī)制具有重要意義。

本研究將2925 個(gè)歸大腸經(jīng)中藥單體與10 個(gè)CRC 相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，篩選出其中與4 個(gè)及以上靶點(diǎn)有作用的中藥單體，共計(jì)30 個(gè)，結(jié)構(gòu)上屬于黃酮類、香豆素類、蒽醌類等，其中除（9）巴豆酸、（14）瑞枯靈、（15）辛夷脂素、（17）金絲桃苷、（23）蒙花苷共5 個(gè)中藥單體未見抗CRC 相關(guān)報(bào)道外，其余25個(gè)單體均有文獻(xiàn)報(bào)道，其藥理作用主要體現(xiàn)在抗增殖、誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移、抗氧化、抗炎以及化學(xué)防御等方面。研究篩選出的與30 個(gè)候選中藥單體相關(guān)度最高的是歸大腸經(jīng)中藥——老鸛草，具有抑制CRC 細(xì)胞增殖的藥效，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。此后，為證明篩選策略的可靠性、準(zhǔn)確性，借助CCK-8檢測(cè)前6 個(gè)中藥單體對(duì)HCT116 細(xì)胞活性的影響，并抽取VEGFR2、MMP-9 這兩個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行機(jī)制層面的驗(yàn)證，抽取VEGFR2、MMP-9 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的原因如下：（1）本研究創(chuàng)新點(diǎn)在于探索一種中醫(yī)歸經(jīng)理論指導(dǎo)下的、快速篩選歸大腸經(jīng)中藥治療CRC 活性成分的方法，進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證的目的是證明篩選策略的可靠性、準(zhǔn)確性，即證實(shí)篩選出的成分確有抗腫瘤活性，并非為了發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)，故抽取了2 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行了初步驗(yàn)證；（2）本課題組前期做過VEGFR2、MMP-9 的相關(guān)研究[13，14]，方法較為成熟，因此對(duì)這兩個(gè)靶點(diǎn)先進(jìn)行初步驗(yàn)證。為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的30 個(gè)潛在活性成分的準(zhǔn)確性，后期將繼續(xù)對(duì)剩余8 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，并深入探究活性成分的抗腫瘤機(jī)制。

本研究基于中醫(yī)歸經(jīng)理論，應(yīng)用系統(tǒng)虛擬藥理學(xué)，建立一種快速、靶向明確的篩選中藥活性成分新方法，初步闡明了歸經(jīng)理論在藥物篩選中的指導(dǎo)價(jià)值，為快速篩選中藥抗腫瘤活性成分研究提供新思路。研究篩選出的30 個(gè)候選活性化合物，后續(xù)可憑借藥物化學(xué)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或改造，最終為單用或聯(lián)合用藥提供更多的藥物來源。