蘇巧玲，李秀敏

閩南師范大學(xué) 菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建漳州363000

黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤[1]，由異常黑色素細(xì)胞過度增生引發(fā)的皮膚腫瘤，具有惡性程度高、死亡率高的特點(diǎn)，且發(fā)病率逐年上升，主要表現(xiàn)為皮膚色素痣的形態(tài)和顏色改變，容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等[2]。相關(guān)研究顯示，黑色素瘤目前的發(fā)病機(jī)制尚不明確，如果患者長時(shí)間在日光紫外線中暴露，會(huì)增加患黑色素瘤的風(fēng)險(xiǎn)[3]。黑色素瘤發(fā)病較為隱匿，并且轉(zhuǎn)移時(shí)間早，容易復(fù)發(fā)，部分患者存在放、化療抵抗，因此死亡率較高[4]。尋找高效低毒的天然產(chǎn)物對(duì)改善黑色素瘤的治療是十分有意義的。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因子參與的連續(xù)的、復(fù)雜的過程，經(jīng)過不斷增殖最終形成轉(zhuǎn)移灶。與自發(fā)轉(zhuǎn)移模型相比，將B16 黑色素瘤細(xì)胞注射到鼠尾靜脈減少腫瘤發(fā)展的中間狀態(tài)，因其可重復(fù)性和評(píng)估抗轉(zhuǎn)移效果的時(shí)間經(jīng)濟(jì)性而被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[3]。

銀耳別名雪耳、白木耳等，從古至今素有“菌中之冠”的美譽(yù)，是我國廣泛種植的一種可食用菌，營養(yǎng)價(jià)值高，具有較高的藥用價(jià)值[5]。銀耳多糖是銀耳真菌子實(shí)體中最主要的生物活性成分，占銀耳干重的70%～75%。研究證實(shí)，銀耳多糖為雜多糖，其主鏈?zhǔn)怯搔?（1-3）-糖苷鍵組成的甘露聚糖，主鏈的2、4、6 位上連接有葡萄糖、木糖、巖藻糖及糖醛酸等殘基組成的側(cè)鏈，其活性中心為α-（1-3）-甘露聚糖[6]。其常見的功效有免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂、抗氧化、抗衰老等[7-9]作用。本文旨在研究銀耳多糖對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的影響，為進(jìn)一步闡明銀耳多糖抗黑色素瘤的機(jī)制提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銀耳多糖由本中心實(shí)驗(yàn)室依據(jù)銀耳多糖的制備、鑒定與含量測定方法[10]提取獲得；小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 購自于上海細(xì)胞庫；ICR 小鼠，雄性，購自吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)質(zhì)量合格證號(hào)：20180004027908）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

碳酸氫鈉（A.R，廣東西隴化工廠）；Dulbecco's Phosphate Buffered Saline（博士德）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）；TRYPSIN 0.25%（1×）solution（HyClone）；胎牛血清（PAN BIOTECH）；TRIS（Amresco）；甘氨酸（BioFrox）；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）（博士德）；NC 膜（Whatman，protran）；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker（天根）；CD206 抗體（abcam）；PPARγ抗體（CST）；β-Tubulin 抗體（Affinity）；PD-1 抗體（Abcam）；CD86 抗 體（Abcam）；Anti -rabbit IgG（RD）；30%Acr-Bis（29∶1）（博士德）；WesternBright ECL 化學(xué)發(fā)光底物（advansta），Annexin V-FITC/PI（meilunbio）。

電子分析天平（島津，日本）；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（ZEALWAY，美國）；超低溫冰箱（Thermo Fisher，美國）；全波長酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士）；常溫高速離心機(jī)5810 R（eppendorf，德國）；HF safe 生物安全柜（Heal Force）；低溫高速離心機(jī)（BECKMAN，COULTER）；CO2培養(yǎng)箱（ESCO）；IX51 倒置顯微鏡（OLYMPUS）；MicroPublisherTM5.0 RTV 彩 色CCD攝像頭（OLYMPUS）；多維全景流式細(xì)胞儀（Merck Millipore（amnis），德國）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS-SP8，德國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 B16 黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)B16 黑色素瘤細(xì)胞，加入DMEM 完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素），用移液槍輕輕吹打重懸細(xì)胞團(tuán)，調(diào)整細(xì)胞密度，以8 mL/皿的量接種于Φ100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%培養(yǎng)液的培養(yǎng)箱中，待其處于對(duì)數(shù)生長期將細(xì)胞傳代，使細(xì)胞生長至70%～80%，分別設(shè)置空白對(duì)照組、1.25 mg·mL-1TFP 組、2.5 mg·mL-1TFP 組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前，棄去培養(yǎng)液，PBS洗凈。加入0.25%胰酶消化液，輕吹培養(yǎng)皿使細(xì)胞脫落。用移液管吹打細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸液。1000 r·min-1離心細(xì)胞5 min，用PBS 洗2 遍，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106個(gè)/mL。

1.3.2 流式細(xì)胞儀分析①細(xì)胞收集：用不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞并收集到離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106/mL，2000 r·min-1離心3 min，棄去培養(yǎng)液；②用孵育緩沖液洗滌1 次，2000 r·min-1離心3 min；③用100 μL 的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min；④2000 r·min-1離心3 min 沉淀細(xì)胞孵育，緩沖液洗1 次；⑤加入熒光溶液，4 ℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)；⑥流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，CH02 檢測FITC 熒光，CH05 檢測PI；⑦結(jié)果判斷：在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（AnnexinV-FITC-/PI-）；左上象限是壞死細(xì)胞，為（AnnexinV-FITC-/PI+）；右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（AnnexinV-FITC+/PI-），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，顯示為（AnnexinV-FITC+/PI+）。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移小鼠模型的建立4 周齡ICR小鼠（SPF 級(jí)），雄性，于（20±2）℃飼養(yǎng)，相對(duì)濕度50%～60%，黑暗光周期12 h，小鼠可隨意餐食以及飲水。

將小鼠隨機(jī)分成3 組，每組8 只，具體實(shí)驗(yàn)方案如表1 所示。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

接種后，每天觀察腫瘤生長情況，連續(xù)觀察20天后，斷食、不斷水過夜，第二天解剖完整分離成形腫瘤，觀察腫瘤大體病理特征后，通過后續(xù)的蛋白質(zhì)印記分析、HE 染色以及免疫熒光等觀察腫瘤病理學(xué)特點(diǎn)，其中4 只小鼠用來進(jìn)行WB 檢測，4 只用來進(jìn)行HE 染色和免疫熒光。

1.3.4 Western Blot 檢測巨噬細(xì)胞分型及PPARγ表達(dá)將上述收集的肺組織加入RIPA 裂解液，用組織勻漿器勻漿1 min，冰浴振蕩30 min 左右，于4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，收集上清液。

蛋白樣品經(jīng)濃度測定調(diào)成一致和變性后，根據(jù)所測目的蛋白的分子量大小選擇凝膠濃度為10%分離膠；電泳后轉(zhuǎn)膜，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。按1∶1000 稀釋一抗，于4 ℃搖床孵育過夜。

經(jīng)TBST 清洗后，以1∶5000 稀釋二抗，室溫孵育1 h，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，對(duì)蛋白條帶信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行觀察分析。

1.3.5 HE 染色①腫瘤組織脫水包埋后，切成4微米薄片,貼附于載玻片上，42 ℃烘箱過夜；②將切片置于烘箱中，60 ℃烘烤1 h；③脫蠟，梯度酒精復(fù)水；④脫蠟結(jié)束后，將切片浸泡在蒸餾水中，搖床上緩慢搖洗4 min，以洗凈酒精；⑤蘇木素染細(xì)胞核：蘇木素染液染2 min，流水沖洗6 min；⑥1%的鹽酸酒精分化后進(jìn)行伊紅染色：伊紅染色3 min，流水沖洗6 min；⑦脫水封片：將切片依次放入70%、80%、95%乙醇溶液；無水乙醇溶液；乙醇∶二甲苯=1∶1 的混合液；二甲苯溶液后，晾干中性樹膠封片；⑧使用顯微鏡觀察，并在目鏡10×，物鏡20×下拍照。

1.3.6 免疫熒光染色檢測巨噬細(xì)胞分型及PPARγ表達(dá)①～④石蠟切片脫蠟的過程同HE 染色；⑤抗原修復(fù)：將切片置于檸檬酸修復(fù)液中，微波爐中高火加熱5 min；⑥將修復(fù)過的組織切片迅速放入預(yù)熱的蒸餾水中，涼至室溫，搖洗4 min，再換成PBS緩沖液搖洗2 次；⑦3% H2O2滴到切片上，濕盒中避光反應(yīng)，以除去內(nèi)源性過氧化氫酶；⑧加入0.1%tritonX-100 穿膜，室溫穿膜10 min，PBS 搖洗3 次；⑨山羊血清封閉：山羊血清，室溫封閉1 h，PBS 緩沖液搖洗5 次；⑩一抗孵育：切片滴加一抗（1∶100），置于濕盒內(nèi)，4 ℃孵育過夜；11○二抗孵育：切片滴加熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育60 min；12○DAPI 染核：切片滴加DAPI 染液（1∶5000），避光室溫孵育5 min；13○封片：切片滴加適量防熒光淬滅劑（40～50 μL/玻片），室溫過夜封片；14○使用激光共聚焦顯微鏡觀察，并在目鏡10×，油鏡63×下拍照；15○用Image J 統(tǒng)計(jì)分析CD86 熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 TFP 對(duì)B16 凋亡的影響

首先對(duì)各組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測，由圖1可知，1.25 mg·mL-1的TFP 可上調(diào)B16 細(xì)胞的晚期凋亡細(xì)胞數(shù)，對(duì)早期凋亡和死亡細(xì)胞比例無明顯影響；2.5 mg·mL-1的TFP 可上調(diào)B16 細(xì)胞晚期凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)，對(duì)早期凋亡細(xì)胞比例無明顯影響。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測TFP 對(duì)B16 細(xì)胞凋亡的影響

2.2 TFP 抑制B16 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的產(chǎn)生

圖2A 為本實(shí)驗(yàn)的流程圖。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組與TFP 處理組相比體重變化趨勢相似（圖2B），無顯著性差異。靜脈注射20 天后，收集樣本，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，模型小鼠肺內(nèi)布滿黑色素腫瘤結(jié)節(jié)，且體積較大；而1.25 和2.5 mg·mL-1TFP 組小鼠肺內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移明顯少于模型組，有些甚至沒有可見的腫瘤結(jié)節(jié)（圖2C），表明TFP 可顯著抑制B16 細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用。臟器濕重可以體現(xiàn)臟器損傷程度，臟器越重表明黑色素腫瘤轉(zhuǎn)移越多。單因素方差分析各臟器重量顯示，肺濕重3 組間有顯著性差異（F（2，10）=4.309，P=0.049，P<0.05），兩組間的多重比較采用LSD 事后分析。結(jié)果表明，與模型組比較，TFP 1.25 mg·mL-1和TFP 2.5 mg·mL-1組肺濕重顯著降低（P=0.046，P<0.05；P=0.024，P<0.05）。而其它臟器濕重間無顯著性差異。這些結(jié)果表明，不同劑量TFP 給藥后的B16 黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力下降，在一定程度上降低肺損傷。

圖2 TFP 抑制小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的發(fā)生發(fā)展（n=8）

2.3 HE 染色檢測肺組織病理情況

如圖3 所示，肺組織HE 染色結(jié)果顯示，模型組肺組織切片中有較大范圍的黑色素瘤細(xì)胞沉積（紅色箭頭所示），肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，正常肺泡數(shù)目顯著減少；TFP 1.25 mg·mL-1和TFP 2.5 mg·mL-1組肺組織切片基本呈現(xiàn)正常的肺泡結(jié)構(gòu)，并且沒有明顯的黑色素瘤細(xì)胞沉積。

2.4 TFP 對(duì)巨噬細(xì)胞分型的影響

如圖4A 所示，TFP 1.25mg·mL-1和TFP 2.5mg·mL-1組與模型組相比，CD206（巨噬細(xì)胞Ⅱ型標(biāo)志）表達(dá)有顯著上調(diào)趨勢；免疫熒光圖4B 的結(jié)果顯示，TFP 1.25 mg·mL-1組和TFP 2.5 mg·mL-1組與模型組相比，CD86（巨噬細(xì)胞Ⅰ型標(biāo)志）表達(dá)有明顯上調(diào)趨勢。這些結(jié)果表明，經(jīng)TFP 作用后的B16 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺后，可刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞向轉(zhuǎn)移瘤處募集，CD86 和CD206 的表達(dá)均顯著上調(diào)；而對(duì)CD86的上調(diào)顯著強(qiáng)于對(duì)CD206 的上調(diào)（圖4A、4C），表明對(duì)M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞的招募差異，并且以M1型巨噬細(xì)胞為主，M1 型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原，參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能。

圖4 TFP 促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞浸潤（n=4）

PD1 是免疫球蛋白B7 家族的成員之一，常表達(dá)于T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜，也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。模型組中PD1 的表達(dá)不完全與CD86 共定位，不共定位的PD1 上調(diào)表明模型組的B16 黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)PD1。TFP 1.25 mg·mL-1組和TF P2.5 mg·mL-1組與模型組相比，PD1 表達(dá)與CD86 有較好的共定位且呈上調(diào)趨勢，表明TFP 作用后的B16 細(xì)胞有招募I 型巨噬細(xì)胞的作用；但基本不存在不與CD86 共定位的PD1，表明TFP 抑制PD1 在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)。以上結(jié)果說明TFP 通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞的PD1，抑制與PDL1 的結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。以上結(jié)果說明，TFP 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤，且以I 型巨噬細(xì)胞為主。

2.5 TFP 對(duì)PPARγ 蛋白的調(diào)節(jié)作用

PPAR 是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄子，其功能廣泛，可分為PPARα、PPARδ、PPARγ 3個(gè)亞群，其中PPARα、PPARγ 與炎癥反應(yīng)關(guān)系十分密切，在人和小鼠單核巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)促炎基因的表達(dá)。PPAR 被認(rèn)為具有阻止巨噬細(xì)胞向M1 型極化的作用；PPARγ 的表達(dá)能被IL-4 及IL-13 誘導(dǎo)，這提示PPAR 參與M2 的極化過程，PPAR 可以與PPARγ 輔助活化因子1β 共同作用直接調(diào)節(jié)M2 型標(biāo)志物Arg1 的表達(dá)水平，使用巨噬細(xì)胞敲除PPARγ 的小鼠，發(fā)現(xiàn)PPARγ 對(duì)于M2 型巨噬細(xì)胞的成熟是不可或缺的。

如圖5A 所示，WB 檢測結(jié)果顯示TFP 1.25 mg·mL-1組和TFP 2.5 mg·mL-1組PPARγ 蛋白有下調(diào)趨勢，并且與模型組相比，有顯著性差異。

如圖5B 所示，模型組肺切片中PPARγ 蛋白的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，且部分PPARγ 蛋白染色與核染色重疊，表明部分PPARγ 蛋白有入核，處于激活狀態(tài)；而TFP 1.25 mg·mL-1組和TFP 2.5 mg·mL-1組PPARγ 蛋白有明顯下調(diào)趨勢，且PPARγ 蛋白入核比較少，說明PPARγ 蛋白處于失活狀態(tài)。

圖5 TFP 下調(diào)PPARγ 的表達(dá)（n=4）

經(jīng)TFP 作用后的B16 細(xì)胞，下調(diào)PPARγ 的表達(dá)，并使之處于失活狀態(tài)，招募巨噬細(xì)胞到達(dá)腫瘤細(xì)胞聚集的部位；而模型組上調(diào)并激活PPARγ，發(fā)揮抗炎作用，表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞較少被招募在腫瘤細(xì)胞聚集的部位，腫瘤細(xì)胞不斷增殖分裂，從而影響正常肺功能。

3 結(jié)論

免疫和炎癥構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的基本特征。腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，在體內(nèi)不同微環(huán)境的影響下，可極化為M1 型、M2 型巨噬細(xì)胞。M1 型巨噬細(xì)胞吞噬和抗原提呈能力較強(qiáng)，也可直接吞噬和殺傷病原微生物和腫瘤細(xì)胞，并分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子，參與免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能；M2 型巨噬細(xì)胞抗原提呈能力較低，并通過分泌抑制性細(xì)胞因子，下調(diào)免疫應(yīng)答，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸，在腫瘤的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

本研究的模型設(shè)計(jì)是介于預(yù)防治療和接種后治療的一種方法，用于檢測腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)分化以及對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的影響。這種方法是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的延續(xù)，把細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)腫瘤微環(huán)境變化聯(lián)系在一起，可觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的進(jìn)一步發(fā)展，以及該變化對(duì)免疫細(xì)胞的影響。這種方法可用于藥物前期篩選，具有一定的創(chuàng)新性和可行性。

綜上所述，銀耳多糖能顯著下調(diào)B16 小鼠黑色素瘤細(xì)胞中PPARγ 的表達(dá)并抑制其活性，招募巨噬細(xì)胞到小鼠肺組織，并以M1 型的巨噬細(xì)胞浸潤為主，M1 型巨噬細(xì)胞可分泌大量促炎物質(zhì)，從而發(fā)揮炎癥反應(yīng)和免疫防御作用。