劉書(shū)蒙，王 蓉，胡曉龍，熊 非，汪 豪**

1 中國(guó)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，南京 210009；2 東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京210009

西紅花為鳶尾科多年生草本植物西紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，亦稱(chēng)藏紅花、番紅花。具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效。西紅花藥材價(jià)格昂貴，產(chǎn)量低，在其種植及采集過(guò)程中，大量花瓣作為廢料而丟棄，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。文獻(xiàn)報(bào)道，西紅花花瓣提取物對(duì)抑郁癥、阿爾茨海默病、眼睛黃斑變性等疾病具有改善作用[1]。為了揭示西紅花花瓣藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及為西紅花花瓣綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，本研究對(duì)西紅花花瓣進(jìn)行較為系統(tǒng)的化學(xué)成分研究。共分離鑒定9 個(gè)化合物，分別為:苯乙醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（1），芐醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羥基-3′′-甲基戊二酸單酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷（2），苯乙醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羥基-3′′-甲基戊二酸單酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷（3），4-羥基苯甲酸4-O-α-L-吡喃鼠李糖-1-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷（4），4-羥基苯甲酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（5），菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（6），山柰酚（7），山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8），山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）。各成分結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。其中化合物4 為新化合物，化合物1～3，5～6 均為首次從該植物中分離得到。通過(guò)對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的評(píng)價(jià)，化合物2～5 具有中等神經(jīng)保護(hù)作用。見(jiàn)表1。

表1 化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12 巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用（n=3）

圖1 化合物1～9 結(jié)構(gòu)式

1 材料與儀器

西紅花（Crocus sativus L.）花瓣，于2018 年11月采自云南迪慶，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)汪豪教授鑒定為西紅花（Crocus sativus L.）花瓣，標(biāo)本存放于中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)研究室。

Avance-300 or 500 核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent 6210 QTOF 質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；LC-20AP 制備HPLC、LC-MS 2020 質(zhì)譜儀（日本Shimadzu 公司）；MCP500高精度自動(dòng)旋光儀（奧地利Aton Paar 公司）。

HPD-100 型大孔吸附樹(shù)脂（0.3～1.2 mm，天津海光化工有限公司）；高效薄層色譜硅膠預(yù)制板（煙臺(tái)化工研究所）；Sephadex LH-20 色譜填料（瑞典Pharmacia 公司）；ODS 色譜填料（50μm，日本YMC 公司）。

2 方 法

2.1 提取與分離

西紅花花瓣0.78 kg，干燥后粉碎，95%乙醇室溫浸漬提?。?d×3），合并醇提液，減壓回收至浸膏狀，加水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到各萃取部位浸膏。合并乙酸乙酯和正丁醇萃取部位，上樣于HPD-100 大孔吸附樹(shù)脂柱，乙醇-水梯度洗脫，分別得到水，20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脫部位。取60%乙醇洗脫部位經(jīng)Sephadex LH-20、ODS 柱色譜及制備型HPLC 制備分離，得到化合物1（22.3 mg），2（16.1 mg），3（9.8 mg），4（13.7 mg），8（53.9 mg），9（38.2 mg）。取20%乙醇洗脫部位經(jīng)Sephadex LH-20 及ODS 柱色譜分離，得到5（34.5 mg）。取80%乙醇洗脫部位經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離，得到化合物7（25.8 mg）。石油醚萃取部位浸膏，加硅膠（100～200 目）拌樣，上樣于硅膠（200～300 目）柱，以氯仿-甲醇梯度洗脫（100∶1→1∶1），氯仿-甲醇（8∶1）洗脫部位經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化，得到化合物6（56.2 mg）。

2.2 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液（含青霉素鈉200U·mL-1,鏈霉素100μg·mL-1，pH7.4）PC12 細(xì)胞稀釋為每毫升含1×105個(gè)細(xì)胞，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100μL，放入37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后，吸去培養(yǎng)液。然后，空白組和模型組加入100 μL 空白培養(yǎng)液，其余各孔加入不同濃度的化合物1～9 和氟西汀，預(yù)給藥4 h。隨后，棄去上清液，加入100μL 含皮質(zhì)酮的培養(yǎng)液（皮質(zhì)酮終濃度為700 μmol·L-1），刺激24h。最后，每孔加入10μL MTT 溶液（終濃度為0.5mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4h 后棄去上清液，加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩，待藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A值），計(jì)算細(xì)胞保護(hù)率，求得EC50值（Graphpad 8.0）。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 化合物4 的關(guān)鍵信號(hào)

表2 化合物4 的核磁數(shù)據(jù)

化合物1 白色粉末，ESI-MS m/z：307 [M+Na]+，分子式為C14H20O6。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ:7.43-7.13（5H，m，H-2，3，4，5，6），4.19（1H，d，J=7.5 Hz，H-1′），3.94（1H，q，J=8.6，7.8 Hz，H-αb），3.65（1H，m，H-αa），3.43-2.91（Glc-H），2.85（2H，t，J=7.0 Hz，Hβ）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：138.7（C-1），128.1（C-2，6），128.8（C-3，5），126.0（C-4），35.6（C-β），70.1（C-α），102.8（C-1′），73.4（C-2′），76.8（C-3′），69.4（C-4′），76.8（C-5′），61.1（C-6′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[3]，鑒定化合物1 為苯乙醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2 白色粉末，HR-ESI-MS m/z:413.1449[M-H]-，分子式為C19H26O10。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ：7.41（2H，m，H-3，7），7.38-7.24（3H，m，H-4，5，6），4.85（1H，br s，H-1b），4.62（1H，d，J=12.0Hz，H-1a），4.49（1H，d，J=11.3 Hz，H-6′b），4.37（1H，d，J=7.0 Hz，H-1′），4.24（1H，dd，J=11.3，5.5 Hz，H-6′a），3.45（1H，m，H-5′），3.35（2H，m，H-3′，4′），3.27（1H，s，H-2′），2.76（2H，s，H-2′′），2.69（2H，s，H-4′′），1.40（3H，s，3′′-Me）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：71.8（C-1），138.9（C-2），129.1（C-3，7）,129.3（C-4，6），128.7（C-5），172.4（C-1′′，5′′），46.3（C-2′′），70.7（C-3′′），27.7（3′′-Me），45.9（C-4′′），103.2（C-1′），74.8（C-2′），77.7（C-3′），71.4（C-4′），75.9（C-5′），64.6（C-6′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[4]，鑒定化合物2 為芐醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羥基-3′′-甲基戊二酸單酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物3 白色粉末，HR-ESI-MS m/z：427.1607[M-H]-，分子式為C20H28O10。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ：7.25（4H，brs，H-4，5，7，8），7.18（1H，s，H-6），4.46（1H，d，J=11.5 Hz，H-6′b），4.32（1H，d，J=7.1 Hz，H-1′），4.21（1H，dd，J=11.0，4.2 Hz，H-6′a），4.02（1H，q，J=7.3 Hz，H-1b），3.76（1H，q，J=8.4，7.8 Hz，H-1a），3.47（1H，s，H-5′），3.32（2H，m，H-3′，4′），3.20（1H，t，J=6.7 Hz，H-2′），2.93（2H，t，J=6.6 Hz，H-2），2.71（2H，s，H-2′′），2.65（2H，s，H-4′′），1.36（3H，s，3′′-Me）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：71.8（C-1），37.0（C-2），139.8（C-3），129.8（C-4，6），127.1（C-5），172.3（C-1′′，5′′），46.5（C-2′′），70.7（C-3′′），27.7（3′′-Me），45.9（C-4′′），104.3（C-1′），74.8（C-2′），77.8（C-3′），71.5（C-4′），75.1（C-5′），64.7（C-6′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[4]，鑒定化合物3 為苯乙醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羥基-3′′-甲基戊二酸單酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物5 白色粉末，ESI-MS m/z：301[M+H]+，分子式為C13H16O8。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ:7.88（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），7.09（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），4.98（1H，d，J=7.5 Hz，H-1′），3.69（1H，d，J=11.6 Hz，H-6′b），3.47（1H，dd，J=11.7，5.4 Hz，H-6′a），3.37（1H，m，H-2′），3.27（2H，t，J=6.2 Hz，H-3′，4′），3.18（1H，d，J=11.1 Hz，H-5′）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：166.9（C-7），124.3（C-1），130.9（C-2，6），115.7（C-3，5），160.6（C-4），100.0（C-1′），73.1（C-2′），76.5（C-3′），69.7（C-4′），77.0（C-5′），60.6（C-6′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[5]，鑒定化合物5 為4-羥基苯甲酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6 白色片狀晶體，ESI-MS m/z：613[M+K]+，分子式為C35H58O6。1H-NMR（300 MHz，Pyridined5）δ：5.20（2H，m，H-7，23），5.10（1H，d，J=8.4 Hz，H-22），5.04（1H，d，J=7.5 Hz，H-1′），4.60（1H，d，J=11.5 Hz，H-6′b），4.42（1H，dd，J=11.6，5.1 Hz，H-6′a），1.09（3H，d，J=6.4 Hz，18-CH3），1.00（3H，d，J=6.4 Hz，21-CH3），0.89（6H，m，26，27-CH3），0.74（3H，s，29-CH3），0.59（3H，s，19-CH3）；13C-NMR（75 MHz，Pyridine-d5）δ：37.8（C-1），30.4（C-2），79.1（C-3），35.2（C-4），40.7（C-5），30.0（C-6），118.3（C-7），139.9（C-8），50.1（C-9），35.0（C-10），22.2（C-11），39.8（C-12），43.9（C-13），55.4（C-14），23.8（C-15），29.3（C-16），56.6（C-17），12.6（C-18），13.5（C-19），31.2（C-20），21.7（C-21），139.0（C-22），130.1（C-23），51.9（C-24），32.6（C-25），22.1（C-26），19.7（C-27），26.1（C-28），12.9（C-29），102.8（C-1′），75.8（C-2′），77.7（C-3′），72.3（C-4′），78.8（C-5′），63.4（C-6′）。以與文獻(xiàn)對(duì)照[6]，鑒定化合物6 為菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物7 黃色粉末，ESI-MS m/z：285[M-H]-，分子式為C15H10O6。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：8.05（2H，d，J=6.5 Hz，H-2′，6′），6.91（2H，d，J=7.1 Hz，H-3′，5′），6.37（1H，s，H-8），6.13（1H，s，H-6）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：156.3（C-2），136.3（C-3），176.8（C-4），160.7（C-5），100.4（C-6），165.8（C-7），93.2（C-8），158.7（C-9），103.7（C-10），122.0（C-1′），128.5（C-2′，6′），115.4（C-H-3′，5′），146.3（C-4′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[7]，鑒定化合物7 為山柰酚。

化合物8 黃色粉末，ESI-MS m/z：447[M-H]-，分子式為C21H20O11。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：12.57（1H，s，OH-5），10.40（2H，br s，OH-7，4′），8.02（2H，s，H-2′，6′），6.90（2H，s，H-3′，5′），6.43（2H，s，H-8），6.21（2H，s，H-6），5.45（1H，d，J=7.3 Hz，H-1′′），3.57-2.90（Glc-H）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：156.2（C-2），133.2（C-3），177.5（C-4），161.2（C-5），98.7（C-6），164.1（C-7），93.6（C-8），156.4（C-9），104.0（C-10），120.9（C-1′），130.9（C-2′，6′），115.1（C-3′，5′），159.9（C-4′），100.9（C-1′′），74.2（C-2′′），77.5（C-3′′），69.9（C-4′′），76.4（C-5′′），60.9（C-6′′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[8]，鑒定化合8 為山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物9 黃色粉末，ESI-MS m/z：447 [M-H]-，分子式為C21H20O11。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：12.48（1H，s，OH-5），8.07（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′），6.94（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′），6.80（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.42（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），5.09（1H，d，J=7.4 Hz，H-1′′）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：147.6（C-2），136.1（C-3），176.2（C-4），160.4（C-5），98.9（C-6），162.8（C-7），94.5（C-8），155.8（C-9），104.8（C-10），121.6（C-1′），129.7（C-2′，6′），115.5（C-3′，5′），159.5（C-4′），100.0（C-1′′），73.2（C-2′′），76.5（C-3′′），69.7（C-4′′），77.2（C-5′′），60.7（C-6′′）。與文獻(xiàn)對(duì)照[9]，鑒定化合物9 為山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3.2 生物活性測(cè)定結(jié)果

采用MTT 比色法評(píng)價(jià)已分離鑒定的9 個(gè)化合物對(duì)皮質(zhì)酮所致PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，化合物2～5 對(duì)皮質(zhì)酮所致PC12 細(xì)胞損傷具有中等保護(hù)作用，EC50值分別38.68、29.26、25.63、45.72 μmol·L-1見(jiàn)表2，陽(yáng)性藥氟西汀EC5015.24μmol·L-1。