楊清滔，谷 江△，趙治國，張永春

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550014；3.武警貴州總隊醫(yī)院外二科，貴陽 550002）

惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性、異型性的生理特性可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相對乏氧環(huán)境產(chǎn)生[1]。缺氧可刺激癌細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)升高，且上調(diào)HIF-1α 表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下增殖[2-4]。研究表明，減弱HIF-1α 的功能可明顯抑制腎癌細(xì)胞增殖[5]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是廣泛存在于葡萄、花生和多種傳統(tǒng)中藥中的一種多酚類化合物，對HIF-1α 有明顯的抑制作用[6]，具有降血脂、抗炎、抗氧化及抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡等生物學(xué)功能[7-9]。但Res對腎癌細(xì)胞抗乏氧增殖的作用及其機(jī)制目前尚未完全闡明。本研究用不同濃度Res 干預(yù)腎癌細(xì)胞，觀察常氧和缺氧環(huán)境下腎癌細(xì)胞的增殖情況、線粒體功能相關(guān)指標(biāo)變化以及HIF-1α 的表達(dá)，探討Res 在腎癌細(xì)胞抗乏氧增殖過程中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人腎癌GRC-1 細(xì)胞株購于上海弗雷堡生物公司。二氯化鈷購于成都科龍化工試劑廠；Res 購于Sigma 公司；總RAN 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR MasterMix 均購于Fermentas 公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于R&D 公司；Fura-2/AM 鈣離子探針購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞分組及處理 將腎癌GRC-1 細(xì)胞分為正常組和缺氧組，缺氧組用150 μmol/L 二氯化鈷干預(yù)GRC-1細(xì)胞48 h[10]，構(gòu)建缺氧GRC-1細(xì)胞模型，正常組在正常氧環(huán)境下培養(yǎng)。兩組培養(yǎng)基中各加入不同濃度（0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和60 μmol/L）Res進(jìn)行干預(yù)。

1.3 RT-qPCR 法檢測HIF-1α 基因表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在PCR 儀器（Eppendorf Mastercycler gradient，22331 型，德國）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃3 min；變性94 ℃30 s，退火30 s，退火溫度均為53 ℃，延伸72 ℃1 min，共35個循環(huán)；終止反應(yīng)72 ℃5 min。引物序列：β-actin 正向：5’-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3’，反向：5’-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3’，片段長度531 bp；HIF-1α 正向：5’-TCCAGCAGACTCAAATACAAGAAC-3’，反向：5’-GTATGTGGGTAGGAGATGGAG ATG-3’，片段長度130 bp。以β-actin作為內(nèi)參，所得條帶經(jīng)Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的基因條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值代表目的基因的相對表達(dá)量。

1.4 HIF-1α 蛋白表達(dá)檢測 采用苯甲基磺酰氟與細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，12 000 r/min離心5 min，取上清，采用ELISA 法檢測細(xì)胞HIF-1α 蛋白表達(dá)。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性 細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h 后每孔加入80 μL 無血清培養(yǎng)基和20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL 二甲基亞砜，低速震蕩10 min 后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度（OD）值。

1.6 熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量 分組處理各組細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用DHanks 液重懸細(xì)胞，再加入Fura-2/AM，37 ℃避光孵育45 min，再用D-Hanks 液洗滌細(xì)胞2 次，3 mL DHanks液重懸細(xì)胞。熒光分光光度計激發(fā)波長分別為340 nm、380 nm，發(fā)射波長510 nm 雙波長測定負(fù)載探針細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7 線粒體的提取及形態(tài)學(xué)鑒定 使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 000 r/min 離心10 min，取上清；10 000 r/min 離心15 min，棄上清，收集沉淀為線粒體。將剛提取的線粒體均勻涂于載玻片上，加0.02%詹納斯綠B 染液，覆蓋玻片浸染10 min，用高倍鏡（400×）觀察線粒體形態(tài)。

1.8 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放程度檢測 提取兩組線粒體懸液，加入測定介質(zhì)P（甘露醇230 mmol/L、蔗糖70 mmol/L、Hepes 3 mmol/L，pH值7.4）至3 mL，搖勻，另取3 mL 測定介質(zhì)P 作為空白對照。mPTP開放可使線粒體內(nèi)膜對甘露醇及蔗糖高通透性導(dǎo)致線粒體發(fā)生膨脹，此時線粒體OD值降低，故可通過檢測OD的變化來間接反映mPTP的開放程度。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒（上海亨代勞生物有限公司）說明書進(jìn)行操作。用752N 型紫外分光光度計（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司）測定540 nm 波長處的OD值。OD值越高，mPTP開放程度越低。

1.9 線粒體膜電位（Δψm）檢測 采用羅丹明123法檢測Δψm：在離體組織線粒體中，Δψm 攝取羅丹明123 導(dǎo)致熒光淬滅，并隨著Δψm 去極化，羅丹明123 熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，故可通過檢測羅丹明123熒光強(qiáng)度變化來間接反映Δψm。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物公司）說明書進(jìn)行操作。用Cary Eclipse 熒光分光光度計檢測激發(fā)光480 nm、發(fā)射光525 nm 波長下Rh 123 的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度越高，Δψm越低。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Res干預(yù)后兩組GRC-1細(xì)胞增殖活性比較 Res 能顯著抑制兩組GRC-1 細(xì)胞增殖（均P＜0.05），兩組細(xì)胞活力均隨Res濃度的增加而逐漸降低（P＜0.05），但缺氧組細(xì)胞活力下降趨勢明顯緩于正常組，且缺氧組在不同濃度Res 干預(yù)下的細(xì)胞活力均顯著高于相同濃度正常組（均P＜0.05），見圖1。

圖1 Res對GRC-1細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 Res 干預(yù)后兩組GRC-1 細(xì)胞HIF-1α 基因及蛋白表達(dá)比較 兩組HIF-1α 基因及蛋白表達(dá)量均隨Res濃度的增加而逐漸降低（均P＜0.05），缺氧組不同濃度Res 干預(yù)后HIF-1α 基因及蛋白表達(dá)量均顯著高于相同濃度正常組（均P＜0.05），見表1。

表1 Res 干預(yù)后兩組GRC-1 細(xì)胞HIF-1α 基因及蛋白表達(dá)量比較

表1 Res 干預(yù)后兩組GRC-1 細(xì)胞HIF-1α 基因及蛋白表達(dá)量比較

與正常組同一濃度比較，aP＜0.05；與本組0 μmol/L 比較，bP＜0.05；與本組20 μmol/L比較，cP＜0.05；與本組40 μmol/L比較，dP＜0.05。

2.3 線粒體形態(tài)學(xué)鑒定 詹納斯綠B 染色結(jié)果顯示，提取的線粒體呈現(xiàn)圓形、橢圓形和桿狀的藍(lán)綠色顆粒，見圖2。

圖2 線粒體的詹納斯綠B染色（400×）

2.4 Res干預(yù)后兩組GRC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量、熒光強(qiáng)度及OD值比較 兩組細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量均隨Res 濃度的增加而逐漸升高（均P＜0.05），缺氧組20 μmol/L、40 μmol/L的Res干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量顯著高于相同濃度正常組（均P＜0.05）；熒光強(qiáng)度越高，Δψm越低。兩組Δψm均隨Res濃度的增加而逐漸降低（均P＜0.05），缺氧組不同濃度Res干預(yù)后Δψm 均顯著低于相同濃度正常組（均P＜0.05）；OD 值越高，mPTP 開放程度越低。兩組mPTP 開放程度均隨Res濃度的增加而逐漸升高（均P＜0.05），缺氧組不同濃度Res干預(yù)后mPTP開放程度均顯著高于相同濃度正常組（均P＜0.05），見表2。

表2 Res干預(yù)后兩組GRC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量、熒光強(qiáng)度及OD值比較

表2 Res干預(yù)后兩組GRC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量、熒光強(qiáng)度及OD值比較

與正常組同一濃度比較，aP＜0.05；與本組0 μmol/L 比較，bP＜0.05；與本組20 μmol/L 比較，cP＜0.05；與本組40 μmol/L比較，dP＜0.05。

3 討論

與正常細(xì)胞比較，惡性腫瘤需要更多氧及能量維持其異常增殖及惡性傾向，其細(xì)胞間乏氧微環(huán)境不可避免，乏氧可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α 穩(wěn)定表達(dá)，繼而激活下游多種靶基因參與對乏氧的局部和整體調(diào)節(jié)[2]；同時，乏氧導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載會增加不溶性磷酸鈣含量[11]，下調(diào)呼吸鏈電子傳遞速度，促氧化磷酸化解偶聯(lián)，影響線粒體功能[12]。線粒體作為氧化磷酸化“能量工廠”，是細(xì)胞維持正常生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；正常情況下，線粒體以電化學(xué)勢能方式將其能量儲存于線粒體內(nèi)膜，偶聯(lián)與ATP生成的質(zhì)子轉(zhuǎn)運引起線粒體膜兩側(cè)離子的不均勻分布，從而形成Δψm，而Δψm 又取決于線粒體內(nèi)外的離子梯度，其中細(xì)胞內(nèi)Ca2+起著關(guān)鍵性作用。Ca2+作為胞內(nèi)介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的重要信使，與線粒體離子平衡、陰離子蛋白交換、電荷轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]，并參與調(diào)控作為線粒體關(guān)鍵樞紐的mPTP，亦影響Δψm，且與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14]。Lemasters 等[15]研究表明，腫瘤由于細(xì)胞自身代謝高、相對乏氧環(huán)境等因素使其持續(xù)存在氧化應(yīng)激，導(dǎo)致鈣超載，進(jìn)而誘發(fā)mPTP開放，但持續(xù)開放的mPTP又將導(dǎo)致Δψm降低或喪失。故本實驗采用二氯化鈷構(gòu)建缺氧GRC-1 細(xì)胞模型，并使用Res干預(yù)正常組和缺氧組細(xì)胞，通過觀察線粒體功能相關(guān)指標(biāo)mPTP、Δψm、鈣離子變化水平，初步探討Res 參與腎癌細(xì)胞抗乏氧增殖的可能發(fā)生機(jī)制。

本實驗首先構(gòu)建了缺氧GRC-1細(xì)胞模型，檢測正常組和缺氧組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α基因及蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組顯著高于正常組，說明缺氧可誘導(dǎo)GRC-1 細(xì)胞表達(dá)HIF-1α 增加，這與既往研究[4]結(jié)果相符。當(dāng)給予不同濃度Res 干預(yù)正常組和缺氧組GRC-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α基因及蛋白表達(dá)逐漸降低，且相同濃度下缺氧組明顯高于正常組，這與缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加，而Res對HIF-1α抑制作用結(jié)果相吻合。本研究進(jìn)一步提取細(xì)胞線粒體，檢測mPTP、Δψm、鈣離子，發(fā)現(xiàn)隨著Res干預(yù)濃度的增加，正常組和缺氧組GRC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量逐漸升高，mPTP 逐漸開放，Δψm 逐漸降低，且變化程度缺氧組明顯高于正常組；然而MTT 結(jié)果提示，正常組和缺氧組GRC-1細(xì)胞增殖活性在Res干預(yù)后均表現(xiàn)出明顯下降作用，但缺氧組下降趨勢明顯緩于正常組，且缺氧組細(xì)胞在不同濃度Res 干預(yù)下的增殖活性均顯著高于相同濃度正常組。

本研究中，正常組細(xì)胞隨著Res 干預(yù)濃度的增加，HIF-1α 表達(dá)水平逐漸下降，細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量逐漸升高，Res 對GRC-1 細(xì)胞的抑制作用可能是通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，誘導(dǎo)mPTP 開放，降低Δψm，使線粒體解偶聯(lián)功能受損，抑制產(chǎn)能而實現(xiàn)；但HIF-1α 是使細(xì)胞抗乏氧的有利基因，Res 升高鈣離子的同時也抑制了HIF-1α，而缺氧又促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，該作用逐漸拮抗了Res 抑制HIF-1α 表達(dá)效能，故缺氧組Res 對細(xì)胞的抑制作用弱于正常組。由此推測：Res可能通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，使mPP開放，ΔΨm降低，使線粒體解偶聯(lián)功能受損，從而抑制細(xì)胞增殖，但該抑制作用隨著Res 對HIF-1α的進(jìn)行性抑制而逐漸減弱，該作用可能參與了腎癌細(xì)胞的抗乏氧增殖機(jī)制。

本研究觀察到Res 能抑制HIF-1α 表達(dá)，并升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，從mPTP開放、Δψm降低層面探討了線粒體結(jié)構(gòu)及功能變化，但本實驗尚不能明確Res對鈣離子水平調(diào)節(jié)后是通過何種途徑作用于線粒體，本組將引入相關(guān)抑制劑或激動劑處理后深入研究其可能的發(fā)生機(jī)制。