王 杰，王曉華，武麗瓊，劉雅賢，郭志遠，梁 莊，侯麗青，賈躍旗△

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院遺傳優(yōu)生科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院超聲醫(yī)學科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010

近年來，隨著分子遺傳學技術(shù)的迅速發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)技術(shù)在臨床上受到了越來越廣泛的關(guān)注。作為一項優(yōu)秀的產(chǎn)前篩查工具，NIPT技術(shù)具有無創(chuàng)、高精度等諸多優(yōu)勢。它主要通過檢測孕婦外周血漿中的胎兒游離DNA(cffDNA)，對21、18、13-三體和性染色體非整倍體(SCAs)進行篩查，大大提高了這幾種染色體病的檢出率。但是，在這項技術(shù)的背后，限制性胎盤嵌合(CPM)一直是困擾大家的難題。CPM是指胎盤內(nèi)同時存在兩種或多種細胞系，其染色體核型與胎兒存在差異，胎兒染色體核型大多正常。早孕期絨毛活檢(CVS)中CPM 的發(fā)生率為1%～2%[1-2]，其中30%～50%的CPM會在妊娠過程中丟失胎盤非整倍體細胞系[3]。而在異常細胞持續(xù)存在的病例中，CPM可能會增加不良妊娠結(jié)局的風險[4]。本研究對在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院進行NIPT檢測陽性的孕婦進行產(chǎn)前診斷，并在引產(chǎn)或生育后取胎盤組織進行熒光原位雜交技術(shù)(FISH)或染色體微陣列分析(CMA)檢測，評估CPM對NIPT結(jié)果的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016-2018年在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心經(jīng)NIPT檢測后，結(jié)果提示高風險的孕婦，經(jīng)產(chǎn)前診斷，在孕婦知情同意的情況下于終止妊娠或足月生產(chǎn)后采集16例胎盤標本。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1NIPT檢測 抽取孕婦外周靜脈血5 mL，置于cffDNA專用真空采血管(康為世紀)中，分別以1 600×g及16 000×g低溫離心10 min后得到血漿標本。按王杰等[5]報道的方法提取血漿游離DNA并制備文庫，DNA文庫經(jīng)質(zhì)控后達到290 bp左右的片段峰值，水平>30 nmol/L。借助于BGI500測序平臺進行測序，利用高分辨率成像系統(tǒng)及生物信息系統(tǒng)轉(zhuǎn)換得待測序列。所得序列經(jīng)與人參考基因組GRCh37/hg19比對確定每一測序reads染色體的定位，計算得出標準化Z值。標本滿足質(zhì)量控制標準(有效數(shù)據(jù)量≥3.5 Mb，無擴增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)時根據(jù)標準化Z值評估檢測結(jié)果，若Z值的絕對值≥3，提示為高風險；Z值介于-3～<3，結(jié)果為低風險。

1.2.2羊水細胞培養(yǎng)及染色體制備 按照實驗室標準流程進行培養(yǎng)、制片、染色等，根據(jù)人類細胞基因組學國際命名體系標準(2020)進行核型分析診斷。

1.2.3胎盤組織的采集 孕婦終止妊娠或足月生產(chǎn)后排出胎盤，分別取胎盤邊緣、胎盤中央近胎兒面、胎盤近臍帶根部母體面組織各2 cm×2 cm，浸泡于裝有無菌PBS的離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.4FISH檢測 (1)樣品載玻片預處理：羊水細胞經(jīng)離心、低滲后滴片固定于載玻片，胎盤組織標本剪碎、60%冰乙酸吹打固定于載玻片，固定好的玻片標本經(jīng)SSC溶液洗滌和胃酶處理，預冷的乙醇溶液固定，將核酸暴露。(2)變性：將玻片和探針分別在變性劑中76 ℃變性。玻片變性后經(jīng)預冷的乙醇溶液固定，待其干燥后，置于60 ℃烤片機上預熱。(3)雜交：將變性后的探針滴于玻片雜交區(qū)，加蓋蓋玻片，封膠，在封閉的濕盒中37 ℃過夜雜交。(4)洗滌：將雜交后的玻片置于變性液中洗滌，洗脫未特異雜交的探針，再用70%乙醇溶液中固定。(5)鏡檢：將洗滌后的玻片經(jīng)DAPI復染劑染色，在熒光顯微鏡下鏡檢。(6)結(jié)果判讀：鏡下進行細胞計數(shù)。每個雜交區(qū)至少計數(shù)50個信號強且無重疊的雜交細胞。如果超過90%的細胞顯示非整倍信號，則判斷為非整倍體；如果10%～60%的細胞顯示非整倍體信號，則可能為嵌合體；如果信號差無法確定則加大細胞計數(shù)至100個。所有標本均在盲法設計下，與染色體核型分析比較。

1.2.5CMA檢測 應用Affymetrix公司的CytoScan HD全基因芯片掃描技術(shù)檢測全基因組拷貝數(shù)變異(CNVs)。標本依次進行PCR擴增、提純、定量、片段化處理，再將DNA溶液標記后加入雜交試劑孵育，載入到芯片中進行雜交反應；洗染芯片后用Affymetrix GeneChip Scaner掃描分析，通過AGCC軟件芯片圖像顯示分析生成原始cel文件，并利用CHAS軟件分析結(jié)果[5]。檢測到的CNVs與基因組數(shù)據(jù)(GRCh37/hg19)進行比對，借助于UCSC、DECIPHER、ISCA CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫、既往文獻及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)，對其臨床意義進行系統(tǒng)的評估和判斷，并按照人類細胞基因組學國際命名體系標準(ISCN2020)進行結(jié)果描述。

2 結(jié) 果

2.1NIPT高風險產(chǎn)前診斷、胎盤檢測結(jié)果 16例NIPT高風險且采集到胎盤的研究標本包含21-三體高風險13例，經(jīng)產(chǎn)前診斷后12例與NIPT結(jié)果一致，引產(chǎn)后對胎盤組織進行FISH/CMA檢測，結(jié)果與NIPT一致。1例產(chǎn)前診斷后胎兒染色體核型未見異常(標本1)，與NIPT檢測結(jié)果不一致；NIPT提示18-三體高風險2例，經(jīng)產(chǎn)前診斷及胎盤檢測后均與NIPT結(jié)果一致；NIPT提示 6號染色體三體高風險1例(標本2)，抽取羊水進行CMA產(chǎn)前診斷后結(jié)果提示胎兒16號染色體存在部分缺失：arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1，與NIPT檢測結(jié)果不一致，該區(qū)域覆蓋了16p13.11微缺失綜合征的全部區(qū)域。

經(jīng)統(tǒng)計，NIPT結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果的一致率為87.5%(14/16)，與胎盤檢測結(jié)果的一致率為93.8%(15/16)。其中NIPT提示21-三體高風險與產(chǎn)前診斷結(jié)果的一致率為92.3%(12/13)，與胎盤檢測結(jié)果的一致率為100.0%(13/13)；NIPT提示18-三體高風險與產(chǎn)前診斷結(jié)果的一致率為100.0%(2/2)，與胎盤檢測的一致率為100.0%(2/2)；NIPT提示6號染色體三體高風險與產(chǎn)前診斷檢測、胎盤檢測結(jié)果均存在偏差。

2.22例NIPT假陽性標本胎盤檢測及孕期回顧性分析 2例標本NIPT假陽性標本，分別在生育或引產(chǎn)后取胎盤組織進行CMA檢測。其中，標本1孕婦(24歲)NIPT提示21-三體高風險，孕期經(jīng)羊水核型分析檢測胎兒核型未見異常(46，XN)。足月分娩后，胎盤多點CMA檢測存在不同比例的嵌合，胎盤邊緣區(qū)域檢測結(jié)果為arr(21)×3[0.4]；胎盤中央近胎兒面為arr(21)×3[0.33]；胎盤近臍帶根部母體面為arr(21)×3[0.25]。對其孕期情況進行回顧分析，該孕婦孕期平順，超聲影像學檢測胎兒生長發(fā)育未見明顯異常。足月?lián)衿谧訉m下段剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠，產(chǎn)一男嬰，新生兒出生體質(zhì)量3.2 kg，外觀無明顯畸形。

標本2孕婦(32歲)NIPT提示6號染色體三體高風險，經(jīng)羊水CMA基因芯片檢測后提示胎兒16號染色體存在部分缺失：arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1。引產(chǎn)后留取胎盤組織經(jīng)CMA檢測后提示存在6號染色體三體嵌合與16p13.11區(qū)域部分缺失，其中胎盤邊緣區(qū)為arr(6)×3[0.25]；胎盤中央近胎兒面區(qū)為arr[GRCh37](6)×3[0.52],16p13.11(14892975_16528123)×1；胎盤近臍帶根部母體面為arr(6)×3[0.4]。對其孕期情況進行回顧，孕早期胎兒頸項透明層(NT)超聲檢測未見異常,但孕中期出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限，影像學檢查提示胎兒雙頂徑頭圍相當于25+5周，腹圍相當于24周，股骨、肱骨相當于22+5周，23+3周時，股骨肱骨<2s，雙側(cè)腎盂分離，分別為左側(cè)寬0.53 cm、右側(cè)寬0.51 cm(圖1)。引產(chǎn)后，胎兒外觀無其他明顯畸形。孕婦及其配偶進行外周血CMA分析，未見異常。

圖1 標本2胎兒雙腎超聲橫切面圖

3 討 論

NIPT技術(shù)自開展以來在全世界范圍內(nèi)得到了廣泛的使用，盡管得到了很高的認可，但是它仍然是一項篩查技術(shù)，還不能完全取代產(chǎn)前診斷技術(shù)。影響NIPT結(jié)果的原因主要來源于母體因素或者胎兒因素，母體因素包括母體本身染色體異常、惡性腫瘤、移植男性器官、組織，胎兒因素包括cffDNA偏低、胎盤嵌合體及雙胎之一消失[1]。由于NIPT技術(shù)主要檢測的是母體血漿中cffDNA，而cffDNA主要來源于胎盤絨毛外層凋亡的滋養(yǎng)層細胞，進入母親外周血液循環(huán)，因此胎盤嵌合體會直接影響NIPT結(jié)果。

在CPM中胎盤多同時存在兩種或多種細胞系，其染色體核型與胎兒存在差異，此時胎兒染色體核型大多正常，這種情況就會導致NIPT假陽性[1,6]。GRATI等[7]對52 673例CVS標本的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，在不同胎盤嵌合類型中都會存在一定比例的13-三體、18-三體和21-三體。隨著大家研究的深入，CPM對NIPT檢測影響的病例陸續(xù)增加。謝潤桂等[8]對86例NIPT假陽性病例進行母血和胎盤的檢測，得出胎盤和母血中異常的游離DNA釋放是NIPT假陽性的主要原因。高雅等[9]報道了1例由于21-三體CPM造成的NIPT假陽性，同時指出羊水穿刺過程中胎盤或胎盤滋養(yǎng)層細胞污染可能引起產(chǎn)前診斷的假陽性。李萌萌等[10]也報道1例由于胎盤存在2-三體、7-三體及21-三體嵌合引起NIPT假陽性的案例，該孕婦在28周時出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩，孕婦本人于37周出現(xiàn)子癇的表現(xiàn)。本研究通過對羊水細胞和胎盤組織的檢測，發(fā)現(xiàn)NIPT結(jié)果與產(chǎn)前診斷的一致率為87.5%，但是與胎盤檢測結(jié)果的一致率可達93.8%。其中NIPT提示的21-三體的高風險與產(chǎn)前診斷結(jié)果的一致率為92.3%(12/13)，胎盤檢測與NIPT結(jié)果的一致率為100.0%(13/13)；18-三體的產(chǎn)前診斷與NIPT結(jié)果的一致率為100.0%(2/2)，胎盤檢測與NIPT結(jié)果的一致率為100.0%(2/2)；6號染色體三體的產(chǎn)前診斷檢測、胎盤檢測與NIPT結(jié)果均存在偏差。

本研究有2例NIPT假陽性標本。其中標本1 NIPT提示21-三體高風險，產(chǎn)前診斷后胎兒染色體核型未見異常。該孕婦孕期平順，超聲影像學檢測胎兒生長發(fā)育未見明顯異常。后足月?lián)衿谧訉m下段剖宮產(chǎn)術(shù)終止妊娠，產(chǎn)一男嬰，新生兒出生體質(zhì)量3.2 kg，外觀無明顯畸形。胎兒出生后多點胎盤檢測后存在不同比例的21-三體嵌合。標本2 NIPT提示 6號染色體三體高風險，抽取羊水進行CMA產(chǎn)前診斷，提示胎兒存在16p13.11部分缺失。已報道攜帶有相同片段缺失的患者主要表現(xiàn)包括中度/重度智力障礙、癲癇、發(fā)育遲緩、前腦無裂畸形、小頭畸形、特殊面容、拇指外翻等[11]。本例受檢者在孕中期出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限，影像學檢查提示胎兒雙頂徑頭圍相當于25+5周，腹圍相當于24周，股骨、肱骨相當于22+5周，23+3周時，股骨肱骨<2s，雙側(cè)腎盂分離，分別為左側(cè)寬0.53 cm、右側(cè)寬0.51 cm。孕婦充分知情，被告之后選擇引產(chǎn)，引產(chǎn)后取胎盤組織進行CMA檢測，結(jié)果提示6號染色體三體嵌合與16p13.11存在1.36M部分缺失。2例經(jīng)產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示NIPT假陽性，胎兒染色體核型和胎盤結(jié)果不一致。標本2孕婦的胎盤多點標本CMA檢測為6號染色體三體與16號染色體微缺失的嵌合，與胎兒的染色體核型結(jié)果不一致，證實本例孕婦胎盤存在CPM。該孕婦在孕25周出現(xiàn)胎兒生長受限，推測是CPM導致的[12-14]。標本1孕婦胎兒孕期生長發(fā)育良好，可能是由于胎盤中異常細胞比例較低，對胎兒血液供應影響較小所致。進一步說明CPM是引起NIPT結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致的重要原因，因此對于NIPT高風險的孕婦建議通過侵入性診斷來進一步明確診斷，不能單純基于NIPT結(jié)果來決定終止妊娠。

綜上所述，由于NIPT檢測存在假陽性及假陰性等局限性，對于高風險的孕婦需進行產(chǎn)前診斷以明確診斷。對于檢測結(jié)果高度提示為CPM的孕婦，妊娠期應加強對胎兒在宮內(nèi)發(fā)育情況的監(jiān)測，當出現(xiàn)胎兒生長受限時，對臍動脈血流及大腦中動脈血流進行檢測，并在后續(xù)分娩時留取胎盤標本，以明確胎盤染色體核型的診斷。