張慧麗　李雪蓮　陳先鋒等

中圖分類(lèi)號(hào)：S 41-32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh. 2020106

油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeria maculan3于2007年被列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，是一種檢疫性真菌。目前，在北美洲的加拿大和墨西哥，南美洲的巴西，大洋洲的澳大利亞，歐洲的英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)等國(guó)家均有分布，但在中國(guó)、日本、韓國(guó)和俄羅斯等國(guó)家還未見(jiàn)發(fā)生危害的報(bào)道口]。導(dǎo)致加拿大、澳大利亞和歐洲地區(qū)油菜籽產(chǎn)量和質(zhì)量損失的主要原因就是油菜莖基潰瘍病的發(fā)生，一般年份可導(dǎo)致產(chǎn)量損失10%～20%，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失可達(dá)30%～50%，甚至更高。油菜莖基潰瘍病菌在全世界導(dǎo)致的油菜每個(gè)生長(zhǎng)季的損失超過(guò)9億美元。目前，我國(guó)口岸檢疫部門(mén)已經(jīng)從澳大利亞、烏克蘭、加拿大等進(jìn)境的油菜籽，新西蘭進(jìn)口的十字花科蔬菜種子中多次檢出該病菌，病菌傳人的風(fēng)險(xiǎn)不斷加劇。中國(guó)是油菜的起源地之一，油菜種植在我國(guó)已有上千年歷史，是我國(guó)種植面積最大的油料作物，也是國(guó)產(chǎn)植物油第一大油源，第二大飼用蛋白源。Fitt等用模擬模型預(yù)測(cè)了我國(guó)南方（長(zhǎng)江流域）油菜種植區(qū)油菜莖基潰瘍病傳人后16年的流行趨勢(shì)，僅長(zhǎng)江流域每年平均損失達(dá)4. 93億美元，同時(shí)還會(huì)對(duì)我國(guó)的十字花科野生植物構(gòu)成重大威脅。

油菜黑脛病（black leg of oilseed rape）是油菜上最嚴(yán)重的真菌病害之一，引起該病害的病原至少有兩種：L.maculans和L.biglobosa。因檢疫工作的需要，L.biglobosa在油菜上引起的病害被稱(chēng)為油菜黑脛病（black leg），L.maculans引起病害稱(chēng)為油菜莖基潰瘍病（phoma stem canker）。油菜莖基潰瘍病菌危害油菜莖基部，致病力強(qiáng)，危害重，是引起油菜產(chǎn)量損失的主要因素，迄今該病菌在我國(guó)未見(jiàn)分布。油菜黑脛病菌致病性弱，引起莖中上部發(fā)病，在我國(guó)已有發(fā)生報(bào)道。這兩種病菌都屬于真菌界Fungi、子囊菌門(mén)Ascomycota、格孢腔菌目Pleosporales、小球腔菌科Leptosphaeriaceae、小球腔菌屬Leptosphaeria。目前，根據(jù)rDNA基因間隔序列（ITS）、β-tubulin（ TUB）和actin（ACT）序列分析，油菜莖基潰瘍病菌種下包括2個(gè)亞種，分別是：L.maculans subsp.brassicae（寄主為蕓薹屬Brassica栽培植物）和L.maculans subsp. lepidii（寄主為獨(dú)行菜屬Lepidium植物）。油菜黑脛病菌種下包括6個(gè)亞種，分別是：L.biglobsa subsp.brassicae、L.biglobsa subsp. thlaspii、L.biglobosasubsp. erysimii、L.biglobosa subsp. canadensis、L.biglobosa subsp.australiensis和L.biglobsa subsp.occiaustralensis.

油菜莖基潰瘍病菌的形態(tài)特征受環(huán)境、培養(yǎng)基和外部條件影響，變化極大。僅用形態(tài)學(xué)特征無(wú)法鑒定油菜莖基潰瘍病菌。由于油菜莖基潰瘍病在全球貿(mào)易中的重要性，快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)油菜莖基潰瘍病的發(fā)生和發(fā)展對(duì)控制該病的傳播和保證油菜籽的品質(zhì)至關(guān)重要。Mahuku等根據(jù)ITS序列設(shè)計(jì)特異引物HV17S/HV26C，對(duì)安大略湖油菜田塊油菜莖基潰瘍病菌分布進(jìn)行了調(diào)查;Liu等基于ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)產(chǎn)物片段大小來(lái)區(qū)分L.maculans和L.biglobosa。周?chē)?guó)梁等、易建平等和陳青等采用特異性引物擴(kuò)增結(jié)合ITS基因序列分析分別從澳大利亞進(jìn)口的油菜籽、新西蘭的青菜種子中成功檢測(cè)到油菜莖基潰瘍病菌。Fernando等采用Liu等設(shè)計(jì)的異性引物對(duì)加拿大油菜種子和油菜籽黑脛病的感染水平進(jìn)行了評(píng)估。周?chē)?guó)梁等根據(jù)ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)了Taq-Man MGB探針，建立了該病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。Song等根據(jù)ITS序列設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，建立了油菜莖基潰瘍病菌巢式PCR檢測(cè)方法。周圓等根據(jù)ITS序列差異，建立了油菜莖基潰瘍病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增一橫向流動(dòng)試紙快速檢測(cè)方法。上述檢測(cè)技術(shù)均是建立在ITS序列分析基礎(chǔ)之上，表明ITS序列能夠有效鑒定劃分油菜莖基潰瘍病菌。

2019年3月，寧波口岸從一批進(jìn)境的澳大利亞大麥中發(fā)現(xiàn)夾雜有大量油菜籽，挑選形態(tài)異常的油菜籽進(jìn)行分離培養(yǎng)后，獲得1株疑似油菜莖基潰瘍病菌的分離物，對(duì)其進(jìn)行了致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察、基因序列比對(duì)分析研究，以期在準(zhǔn)確鑒定該分離物種類(lèi)的基礎(chǔ)上，對(duì)其危害進(jìn)行評(píng)估，為口岸檢疫鑒定、后續(xù)疫情防控及相關(guān)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試樣品

供試油菜籽為2019年3月進(jìn)境澳大利亞大麥中夾雜的油菜籽。致病性測(cè)定用的油菜籽為市售油菜種子。

1.2培養(yǎng)基及主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，含有氯霉素100μg/mL，杭州微生物試劑有限公司，用于病菌分離、純化和保存。

TANBead Plant DNA Auto Kit，臺(tái)灣TANBead公司;2×Taq MasterMix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;100 bp DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司;其他試劑均為分析純;引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3儀器

BX-51型生物顯微鏡，日本Olympus公司;AxioImager Z1型顯微鏡數(shù)碼成像系統(tǒng)、Discovery V12型解剖鏡及其成像系統(tǒng)，德國(guó)Zeiss公司;Friocell222型培養(yǎng)箱，德國(guó)MMM公司;Kingfisher mL核酸自動(dòng)化提取儀、Multiskan G（）生物分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific公司;TProfessional Basic型PCR儀，德國(guó)Biometra公司;PowerPac Basic型電泳設(shè)備和GelDocEQ型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.4病原菌的分離與純化

從大麥中挑選畸形、變色等外觀不正常的油菜籽，采用常規(guī)真菌分離方法對(duì)油菜籽進(jìn)行病原菌分離。1%次氯酸鈉表面消毒3min，無(wú)菌水漂洗3次，在滅菌濾紙上吸干水分后，置于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿放10粒，25℃黑暗培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化，純化后菌株編號(hào)為01829。

1.5分離病原菌菌株的致病性測(cè)定

選取健康的油菜籽播種于育苗盤(pán)中，置于溫度25'C左右、日光條件下育苗間培養(yǎng)。分別在長(zhǎng)出2片子葉和真葉后采用針刺法進(jìn)行菌株01829的致病性測(cè)定。用70%乙醇擦拭子葉和莖基部進(jìn)行表面消毒后，用經(jīng)酒精燈燒過(guò)冷卻后的0號(hào)昆蟲(chóng)針點(diǎn)刺子葉和莖基部，取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d的菌落，用直徑5mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將菌餅有菌絲面放置在刺傷處，上覆蘸有無(wú)菌水的滅菌脫脂棉保濕，接種后置于塑料收納箱內(nèi)并扣上蓋，25℃室溫條件下培養(yǎng)。以接種無(wú)菌PDA為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。接種后每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.6分離病原菌菌株的形態(tài)觀察

將純化的菌株01829接種于直徑9 cm的PDA平板培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)14 d后，觀察記錄其菌落形態(tài)特征。將PDA平板上的供試菌，在解剖鏡下觀察分生孢子器，挑取分生孢子器制片后在顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)特征，并對(duì)其大小進(jìn)行測(cè)量。

1.7分離病原菌菌株的分子生物學(xué)研究

1.7.1基因組DNA提取

用滅菌槍頭刮取在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的01829菌絲體，用TANBead Plant DNA Auto Kit在KingFisher mL核酸自動(dòng)化提取儀上提取病原菌總DNA。提取后DNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，保存于-20℃冰箱備用。

1.7.2特異性引物PCR檢測(cè)

參照出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3685-2013《油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法》中的PCR方法，采用特異性引物L(fēng)MRl-D（5′-GCGTAAGAAGCGTGCCTTAGAGTC-3′/5′-TCCTGCT-CCTACTCCTTCTCTAGC-3′）和Lmb（5′-CACCAATTGGATCCCCTA-3′/5′-AGGCGAGTCCC-AAGTGGAACA-3′），對(duì)菌株01829的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.7.3序列擴(kuò)增和測(cè)序

采用ITS通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株01829總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.7.4序列分析

測(cè)得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確認(rèn)序列的可靠性。使用MEGA 6.0軟件對(duì)測(cè)得的ITS序列與GenBank中下載的油菜莖基潰瘍病菌及其近似種的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，以GenBank上下載的草莖點(diǎn)霉Phoma herbarum的相關(guān)序列為外群，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1000次重抽樣訴計(jì)算系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的置信度。

2結(jié)果與分析

2.1菌株01829的菌落性狀和形態(tài)特征

菌落生長(zhǎng)速度較慢，邊緣不整齊，菌絲呈白色放射狀，多而致密，分枝較多，有分隔（圖1a～b）。分生孢子器褐色至深褐色，球形至扁球形（圖1d），散生、埋生或半埋生于菌絲中，直徑133～334μm，擠壓后釋放大量分生孢子。分生孢子無(wú)色透明，橢圓形或紡錘形，兩端各見(jiàn)1油球，大小（1. 6～6.8）μm×（0.9～2.1）μm（圖1c）。L.biglobosa在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃色色素，菌絲白或微黃;而L.maculans在PDA培養(yǎng)基上無(wú)色素產(chǎn)生，菌絲白色，分枝較多;結(jié)合孢子大小和文獻(xiàn)報(bào)道，初步判斷菌株01829疑似L.maculans。

2.2菌株01829致病性測(cè)定結(jié)果

油菜子葉接種01829菌株2d后開(kāi)始發(fā)病，接種點(diǎn)附近出現(xiàn)圓形枯死斑，淺褐色，稍凹陷。對(duì)照沒(méi)有產(chǎn)生上述癥狀（圖2a）。油菜莖基部接種01829菌株4d后在接種點(diǎn)附近出現(xiàn)褐色病斑，病斑不斷擴(kuò)大，在莖基部形成凹陷的潰瘍斑（圖2b）。對(duì)照沒(méi)有產(chǎn)生上述癥狀（圖2c）。經(jīng)再次分離培養(yǎng)和ITS序列測(cè)定，獲得了與01829形態(tài)和ITS序列一致的菌株。

2.3菌株01829的特異性引物PCR檢測(cè)

用油菜莖基潰瘍病菌特異性引物對(duì)Lmb對(duì)分離物01829的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增得到了約為270bp的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，無(wú)非特異性條帶（圖3）。特異性引物對(duì)LMR1-D擴(kuò)增得到了約為580 bp的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，但有明顯的非特異性條帶，這與王振華等的結(jié)果有所不同。

2.4菌株01829 ITS序列分析

經(jīng)引物ITS1/ITS4擴(kuò)增后獲得長(zhǎng)度為511 bp的ITS片段，GenBank序列登錄號(hào)為MT138669。在GenBank中對(duì)該序列進(jìn)行BLAST搜索和比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列與油菜莖基潰瘍病菌（GenBank登錄號(hào)：DQ458907）ITS序列的相似性為99. 61%;與6個(gè)L.maculans subsp. brassicae的ITS序列相似性為99.14%～99. 36%;與1個(gè)L.maculans subsp. lepidii的ITS序列相似性為94. 91%。進(jìn)一步通過(guò)ITS系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)菌株01829的ITS序列與L.maculanssubsp. brassicae的相關(guān)序列聚在同一個(gè)分支上（boot strap值為99），而L.maculans subsp.lepidii則位于另一個(gè)分支（圖4）。序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株01829為L(zhǎng).maculans subsp. brassicae。

3討論

油菜莖基潰瘍病菌無(wú)性態(tài)為Phoma lingam，其典型形態(tài)特征為產(chǎn)生近球形分生孢子器和分生孢子。本研究中發(fā)現(xiàn)，該病菌只有在早期分離培養(yǎng)時(shí)，可以在培養(yǎng)基上產(chǎn)生分生孢子器，后期多次轉(zhuǎn)代后則難以產(chǎn)生。油菜莖基潰瘍病菌檢測(cè)技術(shù)有分離培養(yǎng)法和PCR方法，PCR以其快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)受到廣泛應(yīng)用。Taylor等根據(jù)一段重復(fù)序列LMR1（5238 bp）設(shè)計(jì)特異引物L(fēng)MR1-D，建立了檢測(cè)油菜莖基潰瘍病菌的PCR方法，王振華等利用該方法從加拿大進(jìn)口油菜籽中檢測(cè)到油菜莖基潰瘍病菌，但是在本研究中，特異性引物對(duì)LMR1-D的擴(kuò)增產(chǎn)物有明顯的非特異性條帶，通過(guò)調(diào)整退火溫度也未能消除。本研究采用了口岸日常檢測(cè)工作中使用的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3685-2013中提供的2對(duì)特異性引物對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，引物對(duì)Lmb擴(kuò)增特異性?xún)?yōu)于引物對(duì)LMR1-D，這一結(jié)果為口岸檢測(cè)人員提供了參考。從基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上可以看出，L.maculans subsp.brassicae和L.maculans subsp. lepidii各成一個(gè)分支，01829與多個(gè)不同地理來(lái)源（荷蘭、加拿大、英國(guó)、美國(guó)、澳大利亞）的L.maculans subsp. brassi-cae位于同一個(gè)分支中，且與多個(gè)來(lái)自澳大利亞的分離物聚在同一個(gè)分支，這與01829來(lái)自澳大利亞是一致的。本研究獲得分離物為L(zhǎng).maculans subsp.brassicae。除油菜莖基潰瘍病菌外，我們也從該批大麥夾雜油菜種子上檢出了油菜黑脛病菌L.biglo-b03a，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道這兩種病菌在澳大利亞均有分布。為提高檢測(cè)工作針對(duì)性，實(shí)際檢測(cè)工作中可采用PCR方法對(duì)油菜籽進(jìn)行初篩，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定工作。

澳大利亞農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)，無(wú)灌溉設(shè)施，作物單產(chǎn)變幅較大，作物輪作模式的研究是澳大利亞農(nóng)業(yè)研究的主要內(nèi)容。油菜對(duì)谷類(lèi)作物根系病害以及單子葉雜草等有明顯的控制效果，是輪作系統(tǒng)中的理想“中斷作物”。因此，澳大利亞在同一田塊上每4年以上種1次油菜。輪作順序依次是：豆科牧草——闊葉作物（油菜）——谷類(lèi)作物（小麥）——闊葉作物（羽扇豆、豌豆等）——谷類(lèi)作物（大麥）。正是由于生產(chǎn)上集中連片種植和全程機(jī)械化，導(dǎo)致油菜籽可能夾雜在澳大利亞出口的各種輪作作物中。據(jù)段維軍等統(tǒng)計(jì)，自從2009年11月上海和江蘇口岸首次截獲該病菌以來(lái)，截止2016年，全國(guó)口岸共截獲該病菌626次。來(lái)源國(guó)包括：加拿大、澳大利亞、法國(guó)、日本、瑞典、荷蘭、美國(guó)、烏克蘭。貨物種類(lèi)包括：油菜籽、小麥、豌豆、大豆、青菜種子、甘藍(lán)種子等。說(shuō)明攜帶這種檢疫性病菌的油菜籽通過(guò)夾雜在其他作物中進(jìn)行傳播的可能性較高。帶菌種子是該病害遠(yuǎn)距離傳播的主要方式，據(jù)Hall等和汪國(guó)平等的研究，種植油菜種子攜帶油菜莖基潰瘍病菌的頻率平均為0. 5%～0.6%，盡管在種植當(dāng)年損失不足1%～2%，但不斷積累的菌源將對(duì)油菜生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅。因此，在日常檢疫中對(duì)夾雜的油菜籽必須加以重視。

以往口岸檢疫研究多針對(duì)進(jìn)口貨物本身，對(duì)其中夾雜物的研究較少。但是，進(jìn)境貨物夾雜物中攜帶多種病菌的可能性很大。近年來(lái)，口岸部門(mén)已多次從進(jìn)境大宗糧油貨物夾雜物中截獲多種檢疫性真菌，如：自烏克蘭玉米夾雜的向日葵種子中截獲向日葵莖潰瘍病菌Diaporthe helianthi;自法國(guó)大麥夾雜的向日葵種子中截獲大麗輪枝菌Verticilliumdahliae;自美國(guó)大豆夾雜的向日葵種子中截獲向日葵莖潰瘍病菌和向日葵黑莖病菌Plenodomuslindquistii等。這些截獲表明：進(jìn)境大宗糧油貨物夾雜物中攜帶檢疫性真菌可能性較高，口岸檢疫部門(mén)應(yīng)予以高度關(guān)注，加強(qiáng)防范，以防檢疫性病原通過(guò)這種方式跨境傳播。