李翰文　劉歡歡　張敏等

中圖分類號：S 432.44 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020114

灑金珊瑚Aucuba jaPonica又名東瀛珊瑚，為桃葉珊瑚屬Aucuba常綠叢生灌木，分布于長江中下游地區(qū)，適應性強，具備耐寒耐旱特性。在當前園林綠化中被廣泛應用，逐漸成為城市的主要綠化植物。關于灑金珊瑚的病害，國外相繼報道過炭疽病、根腐病、白粉病等。而在我國，灑金珊瑚移栽后炭疽病的發(fā)病率較高，危害較為嚴重，已成為灑金珊瑚種植過程中的主要病害。炭疽病由炭疽菌屬Colletotrichum真菌引起，許多炭疽菌存在復合種群，包含很多生物學上的種，目前國外可見殼皮炭疽菌C.crassipes、膠孢炭疽菌C.gloeos-porioides和黑線炭疽菌C.dematium引起灑金珊瑚炭疽病的記錄，國內僅見I。i等12]通過構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，將灑金珊瑚炭疽病的病原菌鑒定為果生炭疽菌C.fructicola。炭疽病普遍存在一病多菌的現(xiàn)象，即一種植物可被幾種炭疽菌侵染，因此灑金珊瑚炭疽病的病原菌還有待進一步確定。筆者從四川成都的6塊樣地，采集疑似灑金珊瑚炭疽病的病葉，對病原菌進行分離純化和致病性測定，通過形態(tài)學特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構建明確灑金珊瑚炭疽病的病原菌種類。

近年來成都市園林植物炭疽病普遍發(fā)生，由于灑金珊瑚常與其他園林植物搭配種植，周圍搭配種植的植物如果發(fā)生炭疽病，是否會成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源目前尚未見報道，筆者將在成都市園林植物上分離獲得的炭疽病病原菌，接種于灑金珊瑚上，若能產(chǎn)生病斑則有可能成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源。明確灑金珊瑚炭疽病病原菌種類及潛在侵染源，可為該病的診斷及科學防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物及病原菌：2017年6月至2018年7月從四川省成都市溫江區(qū)、武侯區(qū)、成華區(qū)、青羊區(qū)、金牛區(qū)及錦江區(qū)采集疑似為炭疽病的灑金珊瑚病葉。健康灑金珊瑚植株，購自四川省成都市溫江區(qū)隨緣花廠。潛在侵染源測定的21株炭疽菌分離自四川省常種植于灑金珊瑚附近的16種園林植物，均由四川農(nóng)業(yè)大學植物保護實驗室提供。

1.2方法

1.2.1病原菌分離純化

采用組織分離法對病原菌進行分離，所得菌株用挑針轉移法進行單孢純化，純化好的菌株于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2致病性測定

取健康灑金珊瑚葉片，無菌水清洗，用脫脂棉蘸取75%乙醇清洗表面，無菌水清洗3次后自然晾干。每張葉片用記號筆均勻分為四部分，每部分中心處用滅菌的梅花針刺傷葉片。處理組在葉片傷口處接種直徑5 mm的菌絲圓片，對照組在傷口處接種同樣大小的無菌PDA圓片。處理組及對照組各接種5片葉，每片葉接種4處，重復3次。處理組及對照組均置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內保濕培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。若對照組不發(fā)病，處理組發(fā)病且癥狀與田間癥狀相似，取發(fā)病部位進行再分離，完成柯赫氏法則的驗證。

1.2.3形態(tài)學觀察

觀察記錄單孢菌株菌落形態(tài)及菌絲生長速率，挑取分生孢子制片，在顯微鏡下觀察分生孢子特征，并隨機選取100個分生孢子測量大小并顯微拍照，參考相關資料從形態(tài)上進行初步鑒定。

參考Yang等的方法誘導產(chǎn)生分生孢子附著胞，參考Cai等的方法誘導產(chǎn)生菌絲附著胞。在25℃黑暗條件下，分生孢子附著胞培養(yǎng)24 h，菌絲附著胞培養(yǎng)7d，觀察附著胞形態(tài)并顯微拍照，隨機選取50個測量大小。

1.2.4多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

收集待測菌株的菌絲體，采用生工生物工程股份有限公司（上海）Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒標準抽提步驟，提取菌絲DNA。采用核糖體內轉錄間隔區(qū)序列（rDNA internal transcribed spacer，ITS）、肌動蛋白基因（actin gene，ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）幾丁質合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS-1）、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）、鈣調蛋白基因（calmodulin gene，CAL）的引物對病原菌DNA進行擴增。引物由生工合成。25.0μL反應體系參考楊友聯(lián)等方法。PCR產(chǎn)物由生工測序。各個基因所得序列與GenBank中的序列比對后，結合峰圖進行手動修改。在GenBank中下載與所測得序列相似性較高的序列及模式菌株序列。用ClustalX 1.81剪切后，按順序首尾相連，以甘薯黑痣病菌Monilochaetes infuscans （CBS869. 96）為外群，用PAUP v4. ob10軟件以最大簡約法（MP）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹所用菌株及登錄號見表1。

1.2.5灑金珊瑚炭疽病潛在侵染源的測定

將在成都市園林植物上分離獲得的炭疽病菌（表4）活化后采用1.2.2的方法，接種于灑金珊瑚上，若能產(chǎn)生病斑則有可能成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源。接種10 d后，統(tǒng)計發(fā)病率，并根據(jù)病斑直徑對致病性強弱進行記錄。如無病斑產(chǎn)生，則無致病性，記為“”;病斑直徑≤5 mm，致病性較弱，計為“+”;5mm<病斑直徑<10 mm，致病性中等，計為“++”;病斑直徑≥10 mm，致病性較強，計為“+++”。

發(fā)病率=（接種后發(fā)病葉片數(shù)/接種總葉片數(shù)）×100%。

2結果與分析

2.1灑金珊瑚炭疽病病原菌的鑒定

2.1.1病原菌的分離培養(yǎng)

從6個采樣地分離出38株疑似為炭疽菌的菌株，單孢純化后根據(jù)菌落特征和孢子形態(tài)，得到22個代表菌株（表2）。

2.1.2致病性測定

將22個單孢菌株活化后回接到健康的灑金珊瑚葉片上，結果表明，接種10 d后，對照葉片均未發(fā)?。▓D1a），接種葉片全部發(fā)?。▓Dlb），癥狀均與自然發(fā)病的相似（圖1c）。從人工接種后發(fā)病葉片中分離病原菌，所得病原菌與原接種菌株特征一致，證明接種菌株均為灑金珊瑚炭疽病的致病菌。

2.1.3形態(tài)學觀察

單孢純化后的菌株，根據(jù)菌落形態(tài)大致分為6類（圖2）。第1類（SJSH8）菌落正面灰黑色，氣生菌絲棉絮狀（圖2第1類a），背面灰黑色，具有輪紋（圖2第1類b）。第2類（ SJSH10）菌落正面中間黑色，邊緣白色，氣生菌絲致密，有較多橘紅色的孢子堆（圖2第2類a），背面中間黑色，邊緣白色，有明顯輪紋（圖2第2類b）。第3類（SJSH22）菌落正面白色，氣生菌絲稀疏（圖2第3類a），背面白色，散生黑色顆粒（圖2第3類b）。第4類（ SJSH1、SJSH9、SJSH11、SJSH14、SJSH16、SJSH17）菌落正面白色，氣生菌絲較多（圖2第4類a），背面淺橘色（圖2第4類b）。第5類（ SJSH2、SJSH3、SJSH5、SJSH6、SJSH7、SJSH12、SJSH15、SJSH19和SJSH21）菌落正面白色，氣生菌絲多（圖2第5類a），背面淺灰色（圖2第5類b）。第6類（SJSH4、SJSH13、SJSH18、SJSH20）菌落正面白色，氣生菌絲稀疏（圖2第6類a），背面白色，具有輪紋（圖2第6類b）。各菌株菌絲生長速率見表3。

在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)（圖2c），第1、4、5、6類為圓柱形，一端鈍圓，另一端鈍圓或稍尖;第2類為橢圓形，較短，兩端鈍圓;第3類為橢圓形，較寬，一端鈍圓，另一端略尖。分生孢子附著胞（圖2d）第1、2類為深褐色，橢圓形或不規(guī)則形，邊緣平滑或不規(guī)則;第3類為深褐色，近球形，邊緣平滑;第4、5、6類為淺褐色至深褐色，近球形，邊緣平滑。菌絲附著胞（圖2e）第1類為深褐色，橢圓形，邊緣平滑;第2、5、6類為淺褐色至深褐色，橢圓形或不規(guī)則形，邊緣平滑或不規(guī)則;第3類為深褐色，不規(guī)則形;第4類為深褐色，近球形，邊緣平滑。各菌株分生孢子、分生孢子附著胞及菌絲附著胞大小見表3。

2.1.4多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建

以甘薯黑痣病菌為外群構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，樹長TL=1230，一致性指數(shù)CI=0. 8805，保留指數(shù)RI=0.9243，校正一致性指數(shù)RC=0. 8138。從發(fā)育樹（圖3）可以看出，第1類菌株（1株）與果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成明顯分支;第2類菌株（1株）與隱秘炭疽菌C.aenigma聚在一起，形成明顯分支;第3類菌株（1株）與喀斯特炭疽菌C.karstii聚在一起，形成明顯分支;第4、5、6類菌株（19株）與暹羅炭疽菌C.siamense聚在一起，形成明顯分支。其他參與分析的炭疽菌與相應的種聚在一起，形成明顯的分支，且每個分支的支持率均較高。結合形態(tài)學特征，將第1類菌株鑒定為果生炭疽菌C.fructicola Prihastuti，L.Cai&K.D. Hyde，第2類菌株鑒定為隱秘炭疽菌C.aenigma B.Weir&P.R.Johnst，第3類菌株鑒定為喀斯特炭疽菌C.karstii Y.L.Yang，Zuo Y.Liu，K.D.Hyde&L. Cai，第4、5、6類菌株鑒定為暹羅炭疽菌C.Siamense Prihastuti，L.Cai&K.D.Hyde。

2.2灑金珊瑚炭疽病潛在侵染源測定

將其他園林植物上分離的炭疽病菌接種灑金珊瑚，除對照未發(fā)病外，其余菌株在人工接種條件下均能不同程度地引起灑金珊瑚發(fā)病，并表現(xiàn)出強弱不同的致病性，具體測定結果見表4。

3討論

來自于溫江區(qū)、武侯區(qū)、成華區(qū)、青羊區(qū)、金牛區(qū)、錦江區(qū)的22株炭疽菌單孢菌株，隸屬于暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌、喀斯特炭疽菌和果生炭疽菌4個種，其中暹羅炭疽菌有19株，占總分離菌株的86.4%，且除成華區(qū)外其余5個區(qū)均分離到暹羅炭疽菌，暹羅炭疽菌應為灑金珊瑚炭疽病的優(yōu)勢致病菌。進一步驗證了一種植物可被幾種炭疽菌所侵染。其中果生炭疽菌引起灑金珊瑚炭疽病的結果與Li等的結果相同。暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌及喀斯特炭疽菌引起灑金珊瑚炭疽病為首次報道。

根據(jù)菌落形態(tài)劃分的部分類型與基于多基因系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定的炭疽菌的種基本吻合，但暹羅炭疽菌存在3類不同的菌落形態(tài)，因而在試驗中不能根據(jù)菌落形態(tài)對菌株種類進行判定。喀斯特炭疽菌分生孢子的長和寬均與暹羅炭疽菌、果生炭疽菌和隱秘炭疽菌有明顯區(qū)別，其分生孢子附著胞在寬度上與其他種的分生孢子附著胞也具有明顯區(qū)別。因此分生孢子和分生孢子附著胞可作為鑒別炭疽菌的參考依據(jù)，但暹羅炭疽菌、果生炭疽菌和隱秘炭疽菌的分生孢子和分生孢子附著胞在長和寬上具有一定的相似度，很難相互區(qū)分。加上很多復合種內甚至不同復合種的炭疽菌常具有相似的形態(tài)特征，若想將炭疽菌準確鑒定到種，還需要結合多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析進一步鑒定。

本文中從其他園林植物上分離所得的21株炭疽菌，在人工接種條件下均可以引起灑金珊瑚發(fā)病，這些病原菌都可能成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源。在園林綠化中，為增加美觀度，普遍是多種植物搭配種植。在自然條件下病原菌很容易在多種不同植物間交互傳播，加重炭疽病的發(fā)生。因此在園林綠化中對炭疽病進行防治時，應對區(qū)域內所有植物統(tǒng)籌制定防治措施，本試驗研究結果可為園林綠化中炭疽病的防治奠定基礎。