劉沁榮，杜紫微，李佳珍，王一碩, 3*，顧 選，崔秀梅

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2.國藥集團(tuán)北京華邈藥業(yè)有限公司，北京 102600 3.河南省中藥生產(chǎn)一體化工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046

引 言

丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為臨床常用大宗中藥材，具有活血祛瘀、清心除煩、養(yǎng)血安神的功效[1]?；瘜W(xué)成分種類豐富，包括丹參酮類、丹酚酸類、多糖類和無機(jī)元素等[2-4]，藥理研究表明丹參具有心肌保護(hù)、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用[5]。其臨床應(yīng)用廣泛，現(xiàn)以丹參為主的復(fù)方制劑約幾十種，涉及傳統(tǒng)丹膏丸散，注射液、滴丸、膠囊、片劑等。丹參因具有較高藥用價(jià)值市場需求量頗高，但隨著野生資源的減少現(xiàn)以人工栽培為主，其道地產(chǎn)區(qū)有山東、河南、四川、陜西等[6]。

國家藥典規(guī)定丹參入藥部位為根及根莖，根部作為植物和土壤進(jìn)行物質(zhì)能量交換的結(jié)點(diǎn)，對(duì)土壤養(yǎng)分需求較高。目前關(guān)于不同產(chǎn)地丹參的研究有相關(guān)報(bào)道，邵遠(yuǎn)洋等通過測定不同產(chǎn)地鮮丹參活性成分含量，結(jié)果得出丹參質(zhì)量存在產(chǎn)地特異性[7]；趙琦等以不同產(chǎn)地和品系丹參為研究對(duì)象，以產(chǎn)量和含量為考察指標(biāo)，表明生長環(huán)境、土壤對(duì)丹參質(zhì)量影響較大[8]；有學(xué)者對(duì)丹參化學(xué)成分和土壤進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)土壤元素影響著丹參酮成分的合成積累且與藥材活性成分存在相關(guān)性[9]。

原子吸收分光光度法作為一項(xiàng)重要的元素測定方法，在中草藥及成藥分析中起到了重要的作用。無機(jī)元素是自然界植物生長過程中所必需物質(zhì)，是中藥的基本成分和藥材質(zhì)量控制中不可或缺的特征參數(shù)[10]，已有對(duì)不同產(chǎn)地中藥材的礦物元素進(jìn)行研究報(bào)道[11]，但尚未見對(duì)丹參藥材元素和土壤元素間相關(guān)性進(jìn)行探討。以根際土壤和藥材為切入點(diǎn)，采用原子吸收分光光度法對(duì)不同產(chǎn)地丹參藥材及根際土壤中無機(jī)元素進(jìn)行分析，總結(jié)丹參藥材與根際土壤兩者間關(guān)系，以期深入了解因土壤產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)生的質(zhì)量差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Z-2300原子吸收光譜儀(日立高新技術(shù)公司)；WX-4000微波消解儀(上海屹堯科技有限公司)；DKQ趕酸電熱板(上海屹堯科技有限公司)；單元素Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn對(duì)照溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，質(zhì)量濃度均為1 000 mg·L-1)，批號(hào)分別為(GSB0417202004，GSB0417711079，GSB0417382004，GSB0417304112，GSB0417011111，GSB0417710079，GSB0417210073，GSB0417805026)。

1.2 樣品采集與處理

丹參藥材從全國各產(chǎn)區(qū)采集，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)董誠明教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。為避免生長區(qū)域肥力均勻性差異，進(jìn)行多點(diǎn)采樣；采用“抖根法”收集根際土壤，經(jīng)四分法進(jìn)行風(fēng)干處理收集備用，藥材、土壤信息見表1。

表1 藥材及土壤樣品信息

1.3 儀器參數(shù)

檢測原子吸收光譜的最佳儀器工作參數(shù)：空氣流量為15 L·min-1，空氣壓力為0.16 MPa，其他參數(shù)見表2。

表2 原子吸收光譜儀工作參數(shù)

1.4 樣品制備

供試品溶液制備[12]：取各產(chǎn)地丹參樣品粉碎過3號(hào)篩精密稱取丹參樣品粉末約0.5 g，加10 mL硝酸置聚四氟乙烯消解罐，放置6 h后至微波消解儀；精密稱取根際土壤樣品約0.5 g，加6 mL硝酸、3 mL鹽酸、2 mL氫氟酸置聚四氟乙烯消解罐，放至微波消解儀進(jìn)行消解，消解程序見表3。將消解完畢的樣品置80 ℃電熱板趕酸冷卻30 min，加5%硝酸溶液至25 mL容量瓶。精密量取5%稀硝酸溶液10 mL稀釋至50 mL容量瓶，密封待測?？瞻兹芤褐苽渫?。

表3 微波消解儀工作參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：取Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取0，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 mL于25 mL容量瓶中5%稀硝酸稀釋，5%稀硝酸為空白。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 22.0和SIMCA14.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系及檢出限

將Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用5%稀硝酸逐級(jí)稀釋，5%稀硝酸為空白，測定各元素不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程及相關(guān)系數(shù)。單元素同濃度溶液連續(xù)進(jìn)樣11次進(jìn)行檢出限實(shí)驗(yàn)，線性方程及檢出限結(jié)果見表4。

表4 線性回歸方程、檢出限

2.2 精密度試驗(yàn)

取Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素各中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液按照儀器工作參數(shù)重復(fù)測定6次，計(jì)算吸光度值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為0.25%，0.29%，0.12%，0.28%，0.12%，0.17%，0.86%和0.38%，均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.4節(jié)處理丹參樣品6份，按照1.3節(jié)儀器工作參數(shù)測定Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素，結(jié)果所得8種元素吸光度的RSD值分別為0.09%，0.72%，0.15%，0.34%，1.07%，0.25%，0.98%和0.35%，均小于1.10%，表明該法重復(fù)性良好。

2.4 加標(biāo)回收率

稱取已知濃度的丹參樣品粉末，精密加入Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液至一定濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，回收率為100.58%，97.88%，97.04%，101.16%，97.54%，97.03%，99.35%和96.91%，RSD值為1.08%，0.19%，1.67%，1.58%，2.10%，1.23%，0.79%和0.43%，均小于3.0%。

2.5 丹參8種元素含量測定

按照1.4節(jié)處理不同產(chǎn)地丹參樣品，在1.3節(jié)連續(xù)進(jìn)樣3次計(jì)算平均值，結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地丹參無機(jī)元素含量(mg·g-1)

2.6 根際土壤8種元素含量測定

按照1.4節(jié)處理不同產(chǎn)地根際土壤樣品，按1.3節(jié)最佳儀器工作參數(shù)連續(xù)進(jìn)樣3次計(jì)算平均值，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地根際土壤無機(jī)元素含量(mg·g-1)

2.7 數(shù)據(jù)分析

2.7.1 聚類分析

以不同產(chǎn)地丹參8種無機(jī)元素含量結(jié)果為原始數(shù)據(jù)，采用組間連接法，以Euclidean距離為分類依據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示當(dāng)Euclidean距離為25時(shí)，河南、陜西、山東、山西丹參被分為一類，四川單獨(dú)一類；當(dāng)Euclidean距離為8時(shí)，河南和陜西丹參被分為一類，山東、山西丹參分為一類、四川單獨(dú)成類；當(dāng)Euclidean距離為3時(shí)，各產(chǎn)地丹參均被單獨(dú)分為一類，表明不同產(chǎn)地丹參之間存在明顯差異。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同產(chǎn)地丹參無機(jī)元素聚類分析樹狀圖

2.7.2 根際土壤元素與丹參元素相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS Statistics 22.0分析軟件Pearson分析根際土壤和丹參元素含量相關(guān)性，見表7。結(jié)果顯示根際土壤中的Fe、K元素與藥材中的K元素存在正相關(guān)關(guān)系，根際土壤中Na、Mn和Zn元素與藥材中Mn元素含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系；根際土壤中Mg、K、Ca元素與藥材中Ca元素含量與呈正相關(guān)關(guān)系，但Mn、Zn元素含量與藥材中Ca元素呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；另外根際土壤中Mn、Zn元素含量與藥材中Mg、Ca、Mn有一定的相關(guān)關(guān)系。

表7 根際土壤元素與藥材間元素相關(guān)性分析

2.7.3 不同產(chǎn)地丹參元素主成分分析

運(yùn)用SPSS Statistics 22.0分析軟件對(duì)不同產(chǎn)地丹參8種元素含量標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析，見表8和表9。主成分特征值大于1的因子有2.738，2.231和1.756，總貢獻(xiàn)率84.058%，可代表丹參樣品大部分信息。故選擇對(duì)該三個(gè)主成分進(jìn)行分析，第一主成分特征根2.738，貢獻(xiàn)率為34.220%，元素Fe、Cu、Zn在第一主成分有較高載荷，反映此三種元素信息；第二主成分特征根2.231，貢獻(xiàn)率為27.887%，元素Na、K、Mn在第二主成分有較高載荷，反映此三種元素信息；第三主成分特征根1.756，貢獻(xiàn)率為21.951%，元素Mg和Ca在第三主成分有較高載荷，反映此二種元素信息。

表8 主成分分析的特征值和貢獻(xiàn)率

表9 初始因子載荷矩陣

根據(jù)主成分得分計(jì)算綜合得分，綜合得分越高藥材品質(zhì)越高，綜合得分以主成分的貢獻(xiàn)率對(duì)主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均，即主成分總和得分=(主成分1得分×34.220+主成分2得分×27.887+主成分3得分×21.951)/84.058。結(jié)果顯示S8，S9和S10樣品綜合得分明顯高于其他，若以這八種元素作為評(píng)定指標(biāo)，則山東產(chǎn)丹參質(zhì)量較優(yōu)，具體見表10。

表10 不同產(chǎn)地丹參主成分得分和綜合得分

2.7.4 不同產(chǎn)地丹參元素偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

為了進(jìn)一步篩選不同產(chǎn)地丹參樣品質(zhì)量差異的元素，采用SIMCA14.1軟件分別對(duì)不同產(chǎn)地丹參樣品的元素含量進(jìn)行PLS-DA分析，得到變量重要性投影值圖(variable important project，VIP)，見圖2—圖4。其中橫坐標(biāo)為無機(jī)元素編號(hào)，縱坐標(biāo)為VIP值，VIP值越高，對(duì)模型貢獻(xiàn)率越高，由此篩選VIP值>1的元素，結(jié)果顯示對(duì)整體模型差異貢獻(xiàn)由大向小排序?yàn)镹a，K，F(xiàn)e和Mg，推測以上無機(jī)元素可能是造成不同產(chǎn)地丹參質(zhì)量差異的主要影響因素。

圖2 散點(diǎn)圖

圖3 模型驗(yàn)證圖

圖4 VIP圖

3 結(jié) 論

藥用植物的生長發(fā)育和成分合成積累與生態(tài)環(huán)境關(guān)系密切，其中土壤是形成中藥材產(chǎn)量高及質(zhì)量優(yōu)的基礎(chǔ)，土壤的質(zhì)地、pH值及有機(jī)物質(zhì)等指標(biāo)對(duì)植物的根系活力和生長分布有著重要影響，研究驗(yàn)證土壤質(zhì)地直接影響根類中藥材的質(zhì)量品質(zhì)[13]。由中藥材資源調(diào)查結(jié)果顯示四川、山東、河南、陜西、山西為丹參的主產(chǎn)區(qū)[14]，本研究以5個(gè)省份9產(chǎn)區(qū)的丹參及根際土壤為樣品，建立原子吸收分光光度法測定樣品中無機(jī)元素含量，含量測定結(jié)果顯示四川丹參樣品中Fe、K元素含量較高，且該地區(qū)土壤以黏壤土為主，在黏壤土中內(nèi)部陽離子大量交換使得土質(zhì)中鉀元素較為豐富，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之吻合。

中藥材質(zhì)量品質(zhì)和臨床療效與生長區(qū)域環(huán)境息息相關(guān)，因土壤、氣候、產(chǎn)區(qū)等生態(tài)因子差異而發(fā)生成分轉(zhuǎn)化規(guī)律和物質(zhì)積累變化是現(xiàn)研究階段值得探索的問題。以各無機(jī)元素含量為依據(jù)對(duì)5個(gè)產(chǎn)地各樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示河南和陜西丹參被分為一類，山東、山西丹參分為一類，四川單獨(dú)成類，其分類結(jié)果表示道地產(chǎn)區(qū)分布與土壤質(zhì)地差異有一定關(guān)聯(lián)性。另外發(fā)現(xiàn)，丹參根際土壤中的K，Na，Mn和Zn元素與藥材中多個(gè)無機(jī)元素呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，且丹參藥材中Na，K，F(xiàn)e和Mg無機(jī)元素可能是導(dǎo)致不同產(chǎn)地丹參質(zhì)量差異的主要影響因素。在種植過程中是否可以對(duì)根際土壤或植株葉面進(jìn)行相關(guān)元素肥料的噴施，通過控制用量或配比來改善丹參藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，以期全面提升中藥材品質(zhì)，是值得探討且深入研究的課題。

生態(tài)環(huán)境土壤是產(chǎn)生藥材道地差異主要因子之一，創(chuàng)造良好的土壤環(huán)境改良土壤性狀，提供適合不同中藥植物生長發(fā)育的土壤條件，是加強(qiáng)中藥材生產(chǎn)種植培優(yōu)技術(shù)的關(guān)鍵。本研究通過原子吸收分光光度法對(duì)不同產(chǎn)地丹參及根際土壤的無機(jī)元素進(jìn)行測定，以期為丹參質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)相關(guān)研究提供參考，然而本研究就土壤和藥材中元素成分進(jìn)行了探討，后期會(huì)結(jié)合化學(xué)成分和藥效活性進(jìn)行全面研究，以期為藥材質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。