魏詩(shī)謠，王麗揚(yáng)，張信軍，王彥紅

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

Kerstersiagyiorum是一種革蘭陰性菌，為產(chǎn)堿桿菌屬成員。最初于2003年首次從人類的腿部傷口、痰液及糞便中分離出來(lái)，并通過(guò)細(xì)胞脂肪酸分析和16S rDNA基因測(cè)序鑒定[1]。根據(jù)目前已知的報(bào)道，人類感染病例包括慢性中耳炎[2]、下肢慢性傷口感染[3]、尿路感染[4]、慢性骨髓炎[5]等。Kerstersiagyiorum主要從人類下肢傷口中分離出來(lái)，迄今為止并沒有充分資料表明此菌與某些疾病有關(guān)[6]。2019年，從我國(guó)東海采集的褐色海藻表面分離出Kerstersiagyiorum[7]，表明此菌存在于海洋環(huán)境中。2016年，報(bào)告了首例從動(dòng)物身上分離出Kerstersiagyiorum，是從圈養(yǎng)的長(zhǎng)江江豚氣孔中分離出此菌[8]。2020年4月，本實(shí)驗(yàn)室從病死海豚的肝和肺等組織中分離出Kerstersiagyiorum，并對(duì)其進(jìn)行初步分析，為圈養(yǎng)海豚診斷、防治此類細(xì)菌感染方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 生化鑒定管和藥敏紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR反應(yīng)試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 奧林巴斯CX系列生物顯微鏡(奧林巴斯工業(yè)有限公司，型號(hào)：CX21FS1C)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司，型號(hào)：SW-CJ-IL)；恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：GNP9080)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c小鼠4只，雌雄各半，6周齡，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心。

1.4 病例背景 2020年4月，揚(yáng)州某海洋館1只雌性9歲海豚發(fā)生死亡，隨即送至揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行死亡原因調(diào)查，通過(guò)對(duì)死亡海豚進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其心肌有較多散在的白斑，肺組織切面有大量結(jié)節(jié)(圖1)，隨后采集肝臟、肺臟和腎臟等內(nèi)臟器官進(jìn)行病原檢測(cè)。

圖1 海豚心臟和肺臟的組織病變

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)菌分離 將采集備用的海豚肝臟、肺臟和腎臟等病料經(jīng)滅菌接種環(huán)無(wú)菌挑取后接種于綿羊血平板(含5%綿羊血)，置于恒溫培養(yǎng)箱以37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。24 h后挑取單菌落純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)后的分離菌進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.5.2 生化試驗(yàn) 用滅菌接種針挑取經(jīng)純培養(yǎng)后的單菌落接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸鹽和鳥氨酸等一系列生化管，石蠟封口置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，48 h后查看結(jié)果。

1.5.3 16S rDNA序列分析法鑒定 無(wú)菌將分離菌株與去離子水混合后，采取煮沸裂解法制備DNA模板，按照寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的16S rDNA bacterial identification PCR kit說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)部分?jǐn)U增產(chǎn)物，剩余產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.5.4 致病性試驗(yàn) 小鼠分為攻毒組和對(duì)照組，每組雌、雄各1只，參考文獻(xiàn)[9]中所用攻毒劑量，攻毒組小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，菌液濃度為1×109CFU/mL，對(duì)照組注射等量生理鹽水，觀察結(jié)果。采集攻毒致死小鼠肝臟制作觸片，美藍(lán)染色觀察病原形態(tài)。并挑取肝臟組織接種于綿羊血平板，觀察培養(yǎng)的病原是否與分離菌一致。

1.5.5 藥敏試驗(yàn) 采取藥敏紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌株的藥物敏感性，挑取純化后的菌株均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿并貼上藥敏紙片，18種藥敏紙片包括美洛西林(75 μg/片)、復(fù)方新諾明(23.75 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、多黏菌素B(300 U/片)、頭孢哌酮/舒巴坦普生(75/75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)和卡那霉素(30 μg/片)，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)公布的最新抑菌藥敏試驗(yàn)參照標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 挑取死亡海豚肝臟、肺臟和腎臟組織無(wú)菌接種于綿羊血平板，24 h后各組織挑取物均分離出細(xì)菌，在綿羊血平板上長(zhǎng)出灰白色、不透明、邊緣整齊、中央略突起的中等大小菌落(圖2)。將純化后的分離菌進(jìn)行革蘭染色后，顯微鏡觀察結(jié)果為革蘭陰性球菌，呈單個(gè)或雙個(gè)排列(圖3)。

圖2 海豚分離菌株菌落形態(tài)

圖3 海豚革蘭染色陰性球菌鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 生化試驗(yàn) 將純化后的分離菌株接種于生化管37 ℃培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、硝酸鹽、鳥氨酸、七葉苷、賴氨酸脫羧酶、亞硝酸鹽(產(chǎn)氣)、精氨酸反應(yīng)均為陰性，與文獻(xiàn)[10]記載關(guān)于Kerstersiagyiorum的生化特性一致。

2.3 16S rDNA序列分析法鑒定 對(duì)分離菌的DNA模板進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果出現(xiàn)了500 bp左右的目的條帶，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，顯示其與序列號(hào)HM117848.1的Kerstersiagyiorum具有100%同源性(圖4)。

圖4 16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn) 采取腹腔注射的方式攻毒，攻毒后6 h，攻毒組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、顫栗、被毛粗亂的現(xiàn)象，18 h后臥伏不起、呼吸急促、食欲廢絕，24 h左右死亡。對(duì)死亡小鼠剖檢，見其肺臟出血、淤血，肝臟、脾臟略腫大，肝臟邊緣有出血點(diǎn)，腎臟色淡，胃和小腸段充滿黃色液體，腸道液化易破損(圖5)。采集攻毒致死小鼠肝臟制作觸片，美藍(lán)染色后可在顯微鏡下觀察到單個(gè)球菌(圖6)，與分離菌顯微形態(tài)一致，隨后挑取肝臟組織接種于綿羊血平板，可見到白色、不透明菌落(圖7)，與分離菌培養(yǎng)形態(tài)一致。

圖5 小鼠組織病變結(jié)果

圖6 小鼠肝觸片美藍(lán)染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

圖7 小鼠肝組織分離菌株菌落形態(tài)

2.5 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌僅對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)美洛西林、復(fù)方新諾明和氟苯尼考等16種抗菌藥敏感。

3 討論

從送檢海豚的肝臟、肺臟和腎臟組織分離出菌株,通過(guò)常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化試驗(yàn)，16S rDNA序列分析鑒定為Kerstersiagyiorum。致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組小鼠典型的臨床癥狀為呼吸急促，呼吸頻率比較高。剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)其肺部多處密布小出血點(diǎn)，部分肺臟組織淤血。在剖檢海豚時(shí)發(fā)現(xiàn)其肺組織切面有大量結(jié)節(jié)。在人類患者感染Kerstersiagyiorum的病例中，報(bào)道過(guò)1例患有呼吸機(jī)依賴性慢性呼吸衰竭病史的患者在住院期間，氣管膿性分泌物增多，檢查發(fā)現(xiàn)其患有支氣管炎，對(duì)其進(jìn)行小支氣管肺泡灌洗，灌洗液中分離出此菌[11]。小鼠感染Kerstersiagyiorum后呼吸急促的癥狀顯著，Kerstersiagyiorum侵襲宿主呼吸系統(tǒng)相關(guān)機(jī)制的研究有待深入。此外，剖檢試驗(yàn)組小鼠還發(fā)現(xiàn)其胃腸道液化嚴(yán)重，胃內(nèi)有大量黃色黏稠液體，胃腸壁薄弱易碎，幾乎透明，說(shuō)明Kerstersiagyiorum對(duì)宿主的消化系統(tǒng)有較強(qiáng)的攻擊性。

Kerstersiagyiorum對(duì)多種抗菌藥保持敏感性，如市面上常見的阿莫西林、慶大霉素、左氧氟沙星等。此菌對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥，諾氟沙星和環(huán)丙沙星均屬于氟喹諾酮類抗菌藥。Kitagawa等[12]、Pence等[13]和Uysal 等[14]進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果也顯示，Kerstersiagyiorum對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥產(chǎn)生耐藥性。一般來(lái)說(shuō)，此類藥物對(duì)革蘭陰性桿菌較為有效。推測(cè)因?yàn)镵erstersiagyiorum不是常見菌，接觸各類抗生素的時(shí)間較少，所以耐藥性較弱。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果可作為治療Kerstersiagyiorum感染的參考依據(jù)。