葉 鋒，劉麗婭，馬曉菁，謝彩云，谷文喜，馬俊杰，易新萍，鐘 旗

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆 烏魯木齊 830099)

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病[1]，近些年其在我國北方地區(qū)的流行率呈逐年上升趨勢[2]。為了提高動(dòng)物布魯氏菌病的診斷需求，新版國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646—2018)已于2018年9月開始執(zhí)行，在原有診斷技術(shù)的基礎(chǔ)上，增加了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(iELISA)、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等血清學(xué)和病原學(xué)診斷新技術(shù)。由于ELISA方法具有靈敏性高、檢測通量大、人為因素影響小等優(yōu)點(diǎn)，在近些年的布病檢測中得到了廣泛的研究和應(yīng)用[3-4]。前人多有對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、ELISA等方法之間的符合率進(jìn)行評(píng)價(jià)，但較少有對(duì)某種方法的產(chǎn)品間進(jìn)行橫向?qū)Ρ鹊难芯縖5-7]。本試驗(yàn)采用市面上流通的幾種iELISA及cELISA試劑盒，對(duì)采集的300份牛血清樣品進(jìn)行了布病抗體檢測，比對(duì)這些試劑盒在臨床檢測中的應(yīng)用情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 全疆各地采集的荷斯坦、西門塔爾及家養(yǎng)黃牛血清樣品共計(jì)300份。

1.2 試劑 布魯氏菌虎紅凝集試驗(yàn)抗原及陰性、陽性對(duì)照血清，均購自英國APHA公司。檢測用試劑盒，均為市面購買，4種iELISA布病檢測試劑盒以編號(hào)A～D代表，5種cELISA布病抗體檢測試劑盒以編號(hào)E～I(xiàn)代表。

1.3 檢測方法 布魯氏菌病RBT和SAT操作方法及結(jié)果判定按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18646進(jìn)行。ELISA試驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作。本試驗(yàn)先用RBT和SAT試驗(yàn)進(jìn)行血清篩選，再用ELISA試劑盒進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。

1.4 檢測結(jié)果一致性分析 根據(jù)Kappa計(jì)算方法，對(duì)4種iELISA試劑盒和5種cELISA試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行結(jié)果一致性分析。Kappa值越高，表明兩種試劑盒的檢測結(jié)果一致性好;反之則表明一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 RBT及SAT檢測結(jié)果 300份牛血清采用RBT初篩及SAT確診后，其中206份血清為布病抗體陽性，94份血清為布病抗體陰性。

2.2 iELISA試驗(yàn)檢測結(jié)果 應(yīng)用4種不同廠家生產(chǎn)的iELISA布病抗體檢測試劑盒(編號(hào)A～D)對(duì)篩選過的300份牛血清進(jìn)行檢測，顯示其敏感性在97.9%～100.0%，特異性介于18.2%～27.3%，總體符合率在74.3%～77.1%，結(jié)果見表1。

表1 4種iELISA試劑盒檢測牛血清結(jié)果

2.3 cELISA試驗(yàn)檢測結(jié)果 應(yīng)用5種不同廠家生產(chǎn)的cELISA布病抗體檢測試劑盒(編號(hào)E～I(xiàn))對(duì)300份牛血清進(jìn)行檢測，顯示其對(duì)牛血清的檢測敏感性在95.8%～100.0%，特異性介于22.7%～81.8%，總體符合率在74.3%～92.9%。結(jié)果見表2。

表2 5種cELISA試劑盒牛血清檢測結(jié)果

2.4 一致性分析 同時(shí)用A、B、C、D這4種iELISA試劑盒和E、F、G、H、I這5種cELISA試劑盒對(duì)300份牛血清樣品進(jìn)行檢測，其兩兩之間的Kappa 值見表3和表4。

表3 4種iELISA試劑盒兩兩比較的Kappa值

表4 5種cELISA試劑盒兩兩比較的Kappa值

3 討論

根據(jù)我國動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)，臨床血清學(xué)檢測時(shí)，一般選用RBT或iELISA方法進(jìn)行初篩，用SAT或cELISA方法進(jìn)行確診。RBT法具有敏感性高、耗時(shí)短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但也存在交叉反應(yīng)多、假陽性高等缺點(diǎn)。與SAT法聯(lián)用后，可提高早期感染診斷的準(zhǔn)確率[8]。ELISA方法用于布病診斷已有多年的經(jīng)驗(yàn)，iELISA法對(duì)樣本要求量少，敏感性高，結(jié)果量化易于判斷，但也存在較高的假陽性率[9]；cELISA法因敏感性和特異性都較高，是一種很好的確診性試驗(yàn)，在血清學(xué)檢測和奶樣檢測中均有應(yīng)用[10-11]。

目前布病檢測所使用的各種檢測方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)[12-14]，其相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品也存在一定的差異。本試驗(yàn)采用RBT和SAT法對(duì)血清進(jìn)行篩選后，挑選了市面上流通的4種iELISA和5種cELISA布病抗體檢測試劑盒，開展了牛血清布病抗體檢測比對(duì)試驗(yàn)。對(duì)篩選后的牛血清開展檢測后發(fā)現(xiàn)，4種iELISA試劑盒表現(xiàn)出了良好的敏感性，均達(dá)到了95%以上的檢出率，但是其特異性均低于30%(18.2%～27.3%)。這個(gè)結(jié)果符合iELISA作為一種初篩試驗(yàn)方法的定位，即盡量提高其敏感性，不出現(xiàn)漏檢的情況。4種產(chǎn)品與RBT和SAT確定的檢測結(jié)果總體符合率在75%左右(74.3%～77.1%)，與前人的檢測結(jié)果數(shù)據(jù)也基本保持一致[15]。5種cELISA試劑盒均有較好的敏感性(95.8%～100.0%)，在特異性上差異較大。作為一種確診的試驗(yàn)方法，其特異性最高為81.8%，最低僅22.7%，顯示出產(chǎn)品之間存在較大的差異。

檢驗(yàn)兩種檢測結(jié)果之間一致性的有效手段是進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，當(dāng)Kappa>0.75時(shí)，表明2個(gè)結(jié)果高度一致；當(dāng)Kappa值處于0.40～0.75時(shí)，表明結(jié)果一致性較為一般。4種iELISA檢測試劑盒，除了B試劑盒與C試劑盒之間檢測結(jié)果一致性稍低為0.707，其余3種iELISA試劑盒兩兩之間的檢測結(jié)果一致性均大于0.75(0.786～0.916)，表明4種試劑盒檢測結(jié)果高度一致，在用于布病血清學(xué)初篩時(shí)，可以任選其中一種即可。5種cELISA檢測試劑盒，兩兩之間的Kappa值分布在0.394～0.972，其中有5組試劑盒檢測結(jié)果之間的Kappa>0.75，表現(xiàn)出結(jié)果的高度一致性；4組試劑盒檢測結(jié)果之間的Kappa介于0.40～0.75，表明其檢測結(jié)果一致性一般；1組試劑盒檢測結(jié)果Kappa<0.40，表明其檢測結(jié)果之間的一致性較差。

血清學(xué)檢測是布魯氏菌病診斷過程中的重要手段，在檢測過程中，其差異性不僅存在于各方法之間，也存在于不同的產(chǎn)品之間。隨著新的國標(biāo)方法的實(shí)施，ELISA作為一種高通量、易于定性的檢測方法，各種ELISA試劑盒產(chǎn)品將會(huì)大量的進(jìn)入到市場當(dāng)中，因此選擇合適的方法及產(chǎn)品，對(duì)提高布魯氏菌病的臨床診斷準(zhǔn)確率具有重要意義。