崔 悅，高 興，韓麗琴，范琢玉，湯鑫淼，馮 波，關(guān) 皎，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

黃芪桂枝五物湯是國家中醫(yī)藥管理局公布的第一批經(jīng)典名方，來源于漢代張仲景所著的《金匱要略》，主治血痹癥[1]。此方由5味藥材(黃芪、桂枝、芍藥、大棗和生姜)煎煮而成。藥理研究表明，黃芪桂枝五物湯具有保護(hù)心腦血管、鎮(zhèn)痛等作用，也可治療中風(fēng)后遺癥、腦梗[2-6]。作為治療血痹癥的經(jīng)典名方，十分有必要將其拓展到獸醫(yī)獸藥領(lǐng)域進(jìn)行開發(fā)利用，以治療由風(fēng)寒濕熱等造成的動物關(guān)節(jié)麻木、沉重等癥狀，避免由于動物行動不便、活動受限給畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。此方配伍明確，其中黃芪主要活性成分包括皂苷類(如：黃芪甲苷)和黃酮類(如：毛蕊異黃酮苷)，具有保護(hù)神經(jīng)、心血管等作用[7-9]；桂枝主要成分包括有機(jī)酸等(如：桂皮酸)，具有抗病毒、抗炎等作用[10-12]；芍藥中的主要成分包括單萜苷類(如：芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷)，抗炎作用明顯[13-15]。目前，已有文獻(xiàn)采用高效液相色譜(HPLC)方法測定黃芪桂枝五物湯成分含量，但其分離時間較長，靈敏度較低[16-18]。本課題組前期采用超快速液相色譜(UFLC)技術(shù)建立了同時測定黃芪桂枝五物湯中4個活性成分(毛蕊異黃酮、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷)含量的方法，分析時間為18 min[19]。本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上，采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UFLC-MS/MS)技術(shù)同時測定上述4種成分，檢測靈敏度大幅提高，且分析時間僅為11 min，對于提高黃芪桂枝五物湯及其制劑在獸藥行業(yè)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 儀器 3200 QTRAP質(zhì)譜儀(美國AB Sciex)，Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(日本島津)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA)。

1.2 試藥 毛蕊異黃酮苷對照品(批號：18092601)、桂皮酸對照品(批號：180621)、芍藥苷對照品(批號：20030901)、芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號：19121705)，均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。乙腈和甲醇為色譜純(美國Fisher)。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，桂枝為樟科植物肉桂CirmarnomumcassiaPresl的干燥嫩枝，芍藥為毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPALL.的干燥根，生姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鮮根莖，大棗為鼠李科植物棗ZiziphusJujubaMill.的干燥成熟果實，上述藥材均購自吉林大藥房，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院李景華副教授鑒定，均為道地藥材。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75.0 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流動相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～6 min，12%→25%B；6～7 min，25%→45%B；7～11 min，45%→60%B)，平衡時間為5 min，流速為0.4 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI源)，負(fù)離子方式檢測，霧化氣、氣簾氣壓力分別為55 psi、25 psi；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，用于定量的母離子和子離子分別為m/z491.2→m/z283.1(毛蕊異黃酮苷)、m/z147.0→m/z103.0(桂皮酸)、m/z525.0→m/z121.0(芍藥苷)、m/z525.1→m/z121.1(芍藥內(nèi)酯苷)。4個成分的碰撞能量(CE)分別為25、16、37 eV和32 eV。

1.4 溶液的制備

1.4.1 黃芪桂枝五物湯的制備 參照《金匱要略》原文，取黃芪、桂枝、白芍各9 g、生姜18 g、大棗4枚，2次10倍量回流提取，各1 h，合并2次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL。

1.4.2 對照品溶液制備 分別取上述4種對照品，用甲醇制成質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL的各對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液制備 取上述黃芪桂枝五物湯 0.5 mL，加甲醇水溶液(v∶v= 50∶50)25 mL，超聲30 min，續(xù)濾液經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾。

1.5 線性關(guān)系、檢測限和定量限 分別取各對照品溶液適量，用甲醇水溶液(50∶50)配制成系列混合對照品溶液(毛蕊異黃酮苷濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和10.0 μg/mL，桂皮酸濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL和25.0 μg/mL，芍藥苷濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL和100.0 μg/mL，芍藥內(nèi)酯苷濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL和25.0 μg/mL。以對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。將毛蕊異黃酮苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對照品儲備液逐步稀釋后進(jìn)樣，以信噪比(S/N)為3 考察其檢測限，以信噪比(S/N)為10 考察其定量限。

1.6 精密度試驗 取毛蕊異黃酮苷濃度為2.0 μg/mL、桂皮酸質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL、芍藥苷質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL 的混合對照品溶液，平行測定6份，計算批內(nèi)精密度；另取上述混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天測定6份，計算批間精密度。

1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于供試品溶液制備后0、2、4、8、12 h和24 h(室溫下)進(jìn)樣測定。

1.8 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，制備供試品溶液進(jìn)樣測定，計算待測成分含量。

1.9 加樣回收率試驗 取已知含量(毛蕊異黃酮苷含量為0.148 mg/mL，桂皮酸含量為0.112 mg/mL，芍藥苷含量為2.952 mg/mL，芍藥內(nèi)酯苷含量為0.454 mg/mL)同一批次黃芪桂枝五物湯樣品9份，每份0.25 mL，分別加入相當(dāng)于樣品中4種成分含量的80%、100%、120%的對照品溶液，每一量下各3份。進(jìn)樣5 μL測定，計算回收率和RSD值。

1.10 樣品含量測定 稱取6批黃芪桂枝五物湯樣品，每批樣品平行制備3份供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，計算4個成分的含量。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜與色譜圖 4個成分的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖1，對照品和樣品的MRM色譜圖見圖2。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷(A)、桂皮酸(B)、芍藥苷(C)和芍藥內(nèi)酯苷(D)的負(fù)離子產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

圖2 混合對照品(A)和樣品(B)MRM色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢測限和定量限 4個成分的線性回歸方程分別為：

Y=4.372×104X+4.092×103r=0.999 9

Y=1.402×104X-1.276×103r=0.999 8

Y=2.425×104X+7.686×104r=0.999 6

Y=3.974×104X+1.782×104r=0.999 5

結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別在0.2～10.0 μg/mL、0.5～25.0、2.0～100.0 μg/mL和0.5～25.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

毛蕊異黃酮檢測限和定量限分別為4 ng/mL和13 ng/mL；桂皮酸檢測限和定量限分別為167 ng/mL和500 ng/mL；芍藥苷檢測限和定量限分別為23 ng/mL 和73 ng/mL；芍藥內(nèi)酯苷檢測限和定量限分別為14 ng/mL和44 ng/mL。

2.3 精密度試驗 4個成分的批內(nèi)精密度(RSD)分別為1.4%、2.4%、1.3%和2.0%，批間精密度(RSD)分別為2.3%、2.6%、1.2%和1.5%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 4個成分的RSD分別為2.2%、2.2%、0.5%和1.2%，說明毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗 4個成分的重復(fù)性結(jié)果見表1。

表1 黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗 結(jié)果見表2。

表2 黃芪桂枝五物湯樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的回收率

2.7 含量測定 6批樣品測定結(jié)果見表3。黃芪桂枝五物湯中4個活性成分進(jìn)行含量測定，其含量高低順序如下：芍藥苷>芍藥內(nèi)酯苷>毛蕊異黃酮葡萄糖苷>桂皮酸。

表3 黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

3 討論

目前文獻(xiàn)報道的HPLC法測定黃芪桂枝五物湯成分含量的相關(guān)方法測定成分較少、分離時間較長、靈敏度較低[16-18]；與已有的LC-MS法測定黃芪桂枝五物湯成分含量的方法相比[20]，本試驗測定的成分更多、分析時間更短，優(yōu)勢明顯。本課題組前期采用UFLC法同時測定了黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量[19]。本試驗在此基礎(chǔ)上，采用UFLC-MS/MS技術(shù)對上述4個成分進(jìn)行測定。

首先對供試品溶液的處理方法進(jìn)行了考察。前期UFLC法中采用甲醇溶劑提取得到供試品溶液，本試驗中分別考察了甲醇、甲醇水溶液(v∶v=50∶50)和水對供試品溶液提取效果的影響，結(jié)果表明，在本試驗條件下，甲醇水溶液(v∶v=50∶50)提取效果最好，故最終以其作為供試品溶液的提取溶劑。

分別考察了不同種類水相和有機(jī)相對分離效果的影響，考慮到非揮發(fā)性溶劑會對質(zhì)譜系統(tǒng)造成傷害，故本試驗流動相中以甲酸替代前期UFLC方法中的磷酸水溶液，通過對不同濃度的甲酸進(jìn)行考察，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，可獲得較好的分離效果。通過對洗脫程序優(yōu)化，最終確定梯度洗脫(0～6 min，12%→25%B；6～7 min，25%→45%B；7～11 min，45%→60%B)，平衡5 min可獲得較好的分離效果且分析時間較短。4個待測物在(ESI源)負(fù)離子檢測模式下的響應(yīng)更佳。4個成分形成的加合離子如下：毛蕊異黃酮苷m/z491.2[M+HCOO]-，桂皮酸m/z147.0[M-H]-，芍藥苷m/z525.0[M+HCOO]-，芍藥內(nèi)酯苷m/z525.1[M+HCOO]-。通過對不同碰撞能量(CE)進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，能量較低時碎片離子數(shù)量少但穩(wěn)定，能量高時則相反。綜合考慮，毛蕊異黃酮苷、桂皮酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷CE值分別為25、16、37 eV和32eV，此時可獲最佳檢測效果。

4 展望

血痹癥是一種危害很大的病癥，不僅會危害人類健康，也會危害動物的健康，甚至給畜牧產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。黃芪桂枝五物湯作為治療血痹癥的經(jīng)典名方，可望在獸醫(yī)獸藥領(lǐng)域應(yīng)用和開發(fā)。本試驗建立的UFLC-MS/MS方法可為黃芪桂枝五物湯制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。