張疏桐，胡天豪，孫筱峰，陳思懷，張 耕，宋振輝，郭建華

(西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)舊稱魏氏梭菌，可引起人和動物急性腹瀉、壞死性腸炎、腸道出血、氣性壞疽等疾病，是許多國家人和動物食源性感染的重要病原[1-4]。該菌是一種革蘭陽性厭氧菌，菌體直桿狀，邊緣整齊，兩端鈍圓，大小為(0.6～2.4)μm×(1.3～19.0)μm，單在或成雙，短鏈，無鞭毛，不能運(yùn)動，能產(chǎn)生莢膜并釋放毒素。在一般條件下罕見形成芽孢，在適宜的pH、溫度、合適比例的碳源等條件下才可形成芽孢。根據(jù)產(chǎn)生4種致死性毒素(α、β、ε、ι)的能力可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E五個毒素型，每個毒素型均能引起人或畜禽特定的疾病[5-6]。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起羊只腹脹、腹瀉、食欲廢絕甚至突然死亡，感染病例剖檢可見心、肺、腎、胃腸道等多器官壞死、水腫或充血、出血等病變[7]。更為嚴(yán)重的是，該菌感染可引起膘情較好的羊急性死亡，且病死率超過40%[8]。因而，選擇合適的疫苗對防治羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病顯得至關(guān)重要。

本試驗通過對某黑山羊養(yǎng)殖場猝死羊進(jìn)行剖檢觀察，從1只小腸嚴(yán)重出血壞死的羊的回腸內(nèi)容物中分離得到1株溶血性厭氧致病菌，對該菌進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察、生化試驗、藥敏試驗、小鼠致病性試驗，16S rDNA PCR擴(kuò)增及測序、產(chǎn)氣莢膜梭菌毒力基因PCR試驗，旨在鑒定該病原菌藥物敏感性、致病性和毒素分型，為該病防制及疫苗研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病料 某黑山羊養(yǎng)殖場急性死亡羊只，腹部膨大，剖檢后發(fā)現(xiàn)回腸漿膜面嚴(yán)重出血，呈黑色，心包積液。無菌采集病死羊只出血腸段內(nèi)容物作為病原分離材料[9]。

1.2 菌種的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 將病料劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于2.5 L厭氧培養(yǎng)袋中，37 ℃ 培養(yǎng)24 h[10]，挑取單菌落，于腦心浸出液肉湯(Brain heart infusion，BHI)厭氧培養(yǎng)基(5 mL BHI培養(yǎng)基+1 mL 液體石蠟)中37 ℃培養(yǎng)24 h，分別于6、12、18 h和24 h觀察培養(yǎng)基狀態(tài)并記錄，取37 ℃培養(yǎng)24 h的菌液25 μL進(jìn)行涂片，分別進(jìn)行革蘭染色、莢膜染色、芽孢染色和鏡檢。取BHI厭氧培養(yǎng)基中菌種，稀釋至約109CFU/mL(OD600=0.600)，吸取菌液500 μL，加入500 μL 60%無菌甘油，置于-40 ℃保存。

1.3 培養(yǎng)特性觀察 將1.2中厭氧培養(yǎng)基中的菌液稀釋至108CFU/mL，吸取200 μL，分別均勻涂布于20 mL LB瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、BHI瓊脂培養(yǎng)基上，分別置于2.5 L厭氧培養(yǎng)袋和有氧環(huán)境37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生長情況。

1.4 生化特性鑒定 分離菌分別接種于葡萄糖、山梨醇、乳糖、棉子糖、明膠、側(cè)金盞花醇、衛(wèi)矛醇、枸櫞酸鹽等生化反應(yīng)管，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，進(jìn)行生化鑒定；牛乳發(fā)酵試驗，觀察是否出現(xiàn)牛乳洶涌發(fā)酵現(xiàn)象[11]。

1.5 藥敏試驗 吸取0.5麥?zhǔn)蠞舛染?00 μL，均勻涂布于TSA平板，待菌液吸收后，35 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后測量各藥物抑菌圈的大小(mm)，根據(jù)藥敏紙片說明書及抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對各種藥物的敏感程度[12]。

1.6 16S rDNA的PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)報道的16S rDNA 通用引物進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)體系為50 μL：TaqPCR Master Mix(2×,Blue dye)25 μL，27F引物和1492R引物(10 μmol/mL，由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)各1 μL，菌液(108CFU/mL)3 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保溫[13]。

1.7 毒力基因檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]合成plc、cpb、cpe、iap、etx、netB基因的引物(表2)，分別檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε、ι毒素、腸毒素和壞死性腸炎毒素B[14-15]。反應(yīng)體系為25 μL：TaqPCR Master Mix(2×,Blue dye)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/mL，由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)各2 μL，菌懸液2 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫[15]。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因及其引物

1.8 致病性試驗 將20日齡清潔級昆明小鼠分為試驗組和對照組，其中試驗組分為兩組，每組5只小鼠，試驗組的小鼠分別腹腔注射106、108CFU/mL 的分離菌，0.5 mL/只(即5×105CFU組和5×107CFU 組)；對照組的小鼠分別腹腔注射0.5 mL無菌BHI液體培養(yǎng)基。注射后每1 h觀察并記錄1次結(jié)果，觀察小鼠死亡時間；若24 h后，小鼠仍未死亡，則將5×105CFU 組菌液濃度提高至109CFU/mL，繼續(xù)腹腔注射0.5 mL/只(即5×108CFU 組)，試驗結(jié)束將各組小鼠進(jìn)行剖檢，無菌分離腹水劃線接種TSA培養(yǎng)基進(jìn)行病原鑒定[13]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌生長狀況及形態(tài)

2.1.1 細(xì)菌生長狀況 細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上生長良好，呈光滑、灰白色、半透明、微凸起菌落，直徑約5 mm，有明顯的β溶血現(xiàn)象；液體培養(yǎng)基生長6 h時，培養(yǎng)液未渾濁；12 h時培養(yǎng)液開始出現(xiàn)渾濁，但無明顯產(chǎn)氣；18 h時培養(yǎng)液渾濁，有小氣泡產(chǎn)生；24 h 時培養(yǎng)液渾濁，產(chǎn)生大量氣體。

2.1.2 鏡檢形態(tài) 革蘭染色可見革蘭陽性、短棒狀、兩極著染桿菌；孔雀石綠-番紅染色未見明顯芽孢結(jié)構(gòu)，莢膜染色可見清晰莢膜。

2.1.3 培養(yǎng)特性 有氧條件下，該菌在5種培養(yǎng)基上均不生長；厭氧培養(yǎng)袋中，該菌在BHI瓊脂、TSA和鮮血瓊脂3種培養(yǎng)基上均生長良好，在LB瓊脂上生長較差，在麥康凱瓊脂上不生長。

2.2 16S rDNA的PCR與序列分析 將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對，與云南昆明分離得到的編號為MK156683.1(KM-1株)的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性達(dá)到99%。

2.3 生化試驗 發(fā)酵葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵衛(wèi)矛醇、山梨醇、側(cè)金盞花醇和棉子糖，明膠試驗、MR試驗陽性，V-P、靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽利用、H2S試驗均為陰性，脲酶試驗可疑，石蕊牛乳培養(yǎng)基出現(xiàn)該菌特有的“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象(表2)。

表2 分離株生化試驗結(jié)果

2.4 藥敏試驗 經(jīng)藥敏試驗證實，該分離菌株對阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素及多黏菌素B、復(fù)方新諾明耐藥，對紅霉素中度敏感，對其他抗生素高度敏感(表3)。

表3 分離株藥敏試驗結(jié)果

2.5 毒素基因的擴(kuò)增 如圖1所示，僅擴(kuò)增得到α毒素基因plc。

圖1 毒素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.6 致病性試驗 24 h時，對照組、5×105CFU組和5×107CFU組小鼠均不死亡，但5×107CFU組小鼠精神沉郁、食欲減退，將菌液量濃度提高至5×108CFU時，小鼠6 h全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)5×107CFU 組和5×108CFU組小鼠空腸、回腸均有出血現(xiàn)象，5×108CFU組鼠腸道嚴(yán)重出血，且兩組小鼠腹水中均分離得到該菌。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)[17]可知，自1892年首先從人腐敗尸體膨脹產(chǎn)氣的血管中第1次分離得到產(chǎn)氣莢膜梭菌起，產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究就從未停止過。研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起人和動物氣性壞疽、壞死性腸炎、食物中毒、腸毒血癥等嚴(yán)重的傳染性疾病，是一類非常重要的人獸共患病病原，關(guān)系著生物安全和食品安全。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對于產(chǎn)氣莢膜梭菌分子病原學(xué)方面的研究也日趨成熟，不僅有多重PCR對產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素分型的研究[18]，也有對產(chǎn)氣莢膜梭菌基因工程疫苗的研究[19]。再加之產(chǎn)氣莢膜梭菌病具有病死率高、病程極短、感染動物種類多等特點，因此，對其防制方面的研究顯得尤為重要。

本試驗從生產(chǎn)實際出發(fā)，對某黑山羊場壞死性腸炎死亡羊只進(jìn)行腸內(nèi)容物細(xì)菌分離培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、16S rDNA測序、生化試驗、毒力基因PCR檢測證實該分離菌株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。致病性試驗證實小鼠致死量5×107～5×108CFU。經(jīng)藥敏試驗顯示，該菌株對氨基糖苷類抗生素有較強(qiáng)的耐藥性，但對其他抗生素較敏感。后續(xù)的研究中，將對該分離菌株進(jìn)行plc基因全序列擴(kuò)增及測序，并對其進(jìn)行核苷酸序列比對分析，觀察其是否存在堿基位點突變及突變對其毒力的影響。

結(jié)合本試驗結(jié)果，建議該黑山羊養(yǎng)殖場對環(huán)境進(jìn)行全面消毒，對已發(fā)病羊只可注射氨芐西林、青霉素鉀等藥物進(jìn)行治療，并適當(dāng)補(bǔ)液；對未發(fā)病羊只，可緊急接種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防，以免此病的流行。