許中衎 , 王黎霞，張榕珍，張一弛，芳 卉，潘晨帆，張建軍，安 健

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 昌平 102206；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 房山 102442)

雞球蟲病是由艾美耳屬的單種或多種雞球蟲引起的主要侵襲雞腸道的全球性寄生蟲病，是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)疾病之一。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，全球養(yǎng)禽業(yè)每年因球蟲感染造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元[1]。細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性死亡的過(guò)程[2]，它對(duì)于多細(xì)胞生物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的正常進(jìn)行，機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，自穩(wěn)平衡的保持，維持組織穩(wěn)態(tài)，抵御外界各種因素的干擾及在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟，還有維護(hù)正常組織和器官的細(xì)胞恒定與生長(zhǎng)平衡、乃至機(jī)體衰老方面都起著重要的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella,E.tenella)會(huì)抑制宿主細(xì)胞的凋亡[4-5]。

HP基因編碼的蛋白是由本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)的一種柔嫩艾美耳球蟲的外分泌蛋白，目前尚無(wú)該基因及其編碼的蛋白的相關(guān)功能研究論文的發(fā)表。前期對(duì)其進(jìn)行的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白有望成為重要的潛在藥物靶點(diǎn)或疫苗候選抗原。

本試驗(yàn)旨在構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HP，將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，觀察HP基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，探究HP基因是否為柔嫩艾美耳球蟲促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡的主要作用蛋白。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究HP基因的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)蟲株與細(xì)胞E.tenellaB4株，由北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供，分離自昌平某雞場(chǎng)，復(fù)壯周期為3個(gè)月；HD11細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存用于雞球蟲研究的貼壁細(xì)胞系。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡農(nóng)大3號(hào)公雛雞，將其飼喂于無(wú)球蟲及其他病原環(huán)境中，使用不含抗球蟲藥的雛雞飼料，飼喂至14日齡，期間自由采食。

1.1.3 主要試劑 熒光真核表達(dá)載體pEGFP-N1，購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京中美泰和生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；2×TaqDNA聚合酶，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶SacⅠ/EcoR Ⅰ、DNA連接酶，均購(gòu)自美國(guó)NEB公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在NCBI上找到目的基因的mRNA序列，導(dǎo)入DNAMAN軟件分析酶切位點(diǎn)，導(dǎo)入Prime 5.0軟件中設(shè)計(jì)HP基因引物上游引物：5′-GGAGCTCATGGCGGATCAGCTTACCGAG-3′(下劃線部分為SacI酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CGGAATTCTTACTTCGCAAGCATCATTCCCACGAACTCCTCA-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2HP基因的克隆 取柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按7×104個(gè)/只接種于7日齡無(wú)球蟲雞，88 h后剖殺取盲腸，刮腸黏膜，勻漿，使裂殖子游離出來(lái)，100目網(wǎng)篩過(guò)濾勻漿，用洗脫液重懸，過(guò)柱收集純化后的裂殖子。用1 mL TRIzol試劑將得到的裂殖子重懸，按試劑盒說(shuō)明書提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為20 μL:2×TaqDNA聚合酶為10 μL，上、下游引物均為0.5 μL，cDNA模板為2 μL，用ddH20補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min；(94 ℃ 30 s、65.5 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s)×40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 90 s。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，后用凝膠回收試劑盒將其回收，-20 ℃保存。

1.2.3 重組熒光真核表達(dá)載體pEGFP-HP的構(gòu)建 用SacI/EcoR I內(nèi)切酶雙酶切真核表達(dá)載體pEGFP-N1和HP基因，后用凝膠回收試劑盒將酶切產(chǎn)物回收，將真核表達(dá)載體pEGFP-N1和HP基因的酶切產(chǎn)物按1∶3體積比通過(guò)DNA連接酶進(jìn)行連接，接著將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。第2天挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min繼續(xù)過(guò)夜培養(yǎng)，次日取2 μL以上菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，菌液PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，用凝膠回收試劑盒將其回收，并用以上菌液提取質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。之后取大量以上菌液用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pEGFP-HP，-80 ℃保存。

1.2.4 pEGFP-HP轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞 對(duì)生長(zhǎng)狀況好的HD11細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，大約2×105個(gè)/孔，加至24孔板中，在37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染首先需配制轉(zhuǎn)染復(fù)合液，分別配制轉(zhuǎn)染A液和B液，按照質(zhì)粒(μg)和LipofectamineTM2000(μL)1∶1.5的比例進(jìn)行配制，各自室溫靜置5 min后輕輕混勻結(jié)合，再室溫靜置20 min。向HD11細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物100 μL/孔，充分混勻，繼續(xù)放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，添加新的培養(yǎng)液繼續(xù)在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。此試驗(yàn)分別設(shè)置了重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和對(duì)照組，其中對(duì)照組中無(wú)質(zhì)粒，不進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染HD11細(xì)胞42 h后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組和對(duì)照組中細(xì)胞凋亡的情況，將細(xì)胞中的舊培養(yǎng)液棄去，用預(yù)冷的PBS洗3遍，用1×Binding Buffer重懸收集細(xì)胞至密度為1×106個(gè)/mL，室溫避光下向100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10 μL PI，輕輕混勻，15 min后用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的早期凋亡以及晚期凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1HP基因克隆的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小在450 bp(圖1)，與HP基因的實(shí)際大小相一致。結(jié)果說(shuō)明HP基因擴(kuò)增成功。

圖1 HP 基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組真核表達(dá)載體pEGFP-HP的鑒定 將pEGFP質(zhì)粒和HP基因用SacI/EcoR I分別進(jìn)行雙酶切，各取5 μL雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接前的質(zhì)控(圖2)，最終按照亮度比較確定連接比例為1∶3。然后將含有pEGFP-HP重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌液作為模板進(jìn)行PCR鑒定，共挑取8個(gè)陽(yáng)性單菌落，結(jié)果顯示均出現(xiàn)大小在450 bp的條帶(圖3)。之后將其進(jìn)行BLAST分析，證明是HP基因(圖4)。結(jié)果說(shuō)明重組熒光真核表達(dá)載體pEGFP-HP構(gòu)建成功。

圖2 雙酶切產(chǎn)物的電泳分析

圖3 菌液PCR鑒定的電泳分析

圖4 測(cè)序分析

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HP基因的表達(dá) 將pEGFP-HP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細(xì)胞內(nèi)，待至42 h后在熒光顯微鏡下觀察出現(xiàn)綠色熒光(圖5B)；pEGFP空質(zhì)粒組也發(fā)現(xiàn)綠色熒光(圖5A)，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照組無(wú)熒光(圖5C)。結(jié)果證明重組質(zhì)粒pEGFP-HP已轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)且成功在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)。

圖5 轉(zhuǎn)染42 h后的HD11細(xì)胞(400×)

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pEGFP-HP重組質(zhì)粒組正常細(xì)胞占25.77%，早期凋亡細(xì)胞占40.21%，晚期凋亡細(xì)胞占29.90%，死亡細(xì)胞占4.12%；pEGFP空質(zhì)粒組正常細(xì)胞占84.21%，早期凋亡細(xì)胞占6.02%，晚期凋亡細(xì)胞占4.51%，死亡細(xì)胞占5.26%；空白對(duì)照組正常細(xì)胞占73.28%，早期凋亡細(xì)胞占15.27%，晚期凋亡細(xì)胞占6.87%，死亡細(xì)胞占4.58%(圖6)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，pEGFP-HP重組質(zhì)粒組的早期凋亡率極顯著高于pEGFP空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組(P<0.01)。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲感染的雞輕則僅存在輕微的食欲不振、神經(jīng)萎靡，重則導(dǎo)致死亡[6]，故對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的防治方法的研究迫在眉睫。柔嫩艾美耳球蟲是主要侵襲雞腸道的寄生蟲，有研究表明，柔嫩艾美耳球蟲會(huì)通過(guò)影響雞腸道上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來(lái)維持自身良好的寄生環(huán)境[7]，從而保持自身的持續(xù)感染力而不斷繁衍存活下去。細(xì)胞凋亡是機(jī)體為適應(yīng)環(huán)境進(jìn)行的主動(dòng)程序性的細(xì)胞死亡過(guò)程[8]，相較于其他細(xì)胞死亡方式來(lái)說(shuō)是自衛(wèi)性質(zhì)的死亡，具有積極效應(yīng)。關(guān)于球蟲和細(xì)胞凋亡的研究近幾年層出不窮，有研究表明，雞感染柔嫩艾美耳球蟲后，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的凋亡增多，且第2代裂殖生殖期最多[9]；牛柔嫩艾美耳球蟲子孢子的感染能夠抑制牛胎胃腸細(xì)胞(BFGC)和非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO)的細(xì)胞凋亡[10]。以上試驗(yàn)都表明，柔嫩艾美耳球蟲的感染會(huì)影響宿主細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，但球蟲影響細(xì)胞凋亡的具體的作用機(jī)制還尚不清楚。

HP基因編碼的蛋白是由本實(shí)驗(yàn)室前期工作通過(guò)將柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子與馬-達(dá)氏牛腎細(xì)胞(MDBK)進(jìn)行無(wú)血清間接共培養(yǎng)所得到的一種柔嫩艾美耳球蟲的外分泌蛋白，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行的生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HP基因的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其易發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，不含信號(hào)肽，且存在5個(gè)潛在的抗原表位，這些特性說(shuō)明此基因具有重大的體外研究意義。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是分析外源基因或基因產(chǎn)物功能的一個(gè)重要工具[11]，能夠很直觀的得到試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)通過(guò)將HP基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)來(lái)分析它的功能，在本次試驗(yàn)前，我們分別將HP基因轉(zhuǎn)染了MDBK、雞成纖維細(xì)胞(DF-1)以及HD11等雞柔嫩艾美耳球蟲的宿主細(xì)胞，最后發(fā)現(xiàn)HD11的轉(zhuǎn)染效率最佳，故本試驗(yàn)最終選擇了HD11作為試驗(yàn)細(xì)胞。

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建HP基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HP，轉(zhuǎn)染HD11來(lái)探討HP基因的潛在生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。本試驗(yàn)以雞柔嫩艾美耳球蟲HP基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用RT-PCR及分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HP，然后將其轉(zhuǎn)染至HD11細(xì)胞內(nèi)，待至42 h后在熒光顯微鏡下觀察看到綠色熒光，隨后對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，pEGFP空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異不大，說(shuō)明真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP并不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。pEGFP-HP重組質(zhì)粒組的早期凋亡細(xì)胞占40.21%，晚期凋亡細(xì)胞占29.90%，均高于pEGFP空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組，且早期凋亡率顯著高于pEGFP空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組，這說(shuō)明HP基因的出現(xiàn)導(dǎo)致了宿主細(xì)胞的凋亡，且主要誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的早期凋亡。值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)通過(guò)將柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子與MDBK共培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲會(huì)抑制MDBK的細(xì)胞凋亡，看似這2個(gè)結(jié)果有矛盾，其實(shí)不然，因?yàn)橛醒芯勘砻鱗12]，在感染的不同時(shí)間段，柔嫩艾美耳球蟲對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的影響也不同，在柔嫩艾美耳球蟲感染的早期(24 h以內(nèi))，宿主細(xì)胞的凋亡被抑制，而到感染的中后期(24～48 h，48～120 h)，宿主細(xì)胞的凋亡又發(fā)生了促進(jìn)，這也說(shuō)明HP基因在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的中期誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡；又或許HP基因在感染期間都起到了誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的作用，這可以說(shuō)明柔嫩艾美耳球蟲參與影響宿主細(xì)胞凋亡的蛋白各自發(fā)揮著不同的作用，其最終目的都是為了更好的生長(zhǎng)發(fā)育、繁衍后代。因?yàn)檗D(zhuǎn)染細(xì)胞36～48 h后的外源基因才能轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，且效果最佳，而此時(shí)都屬于感染中期，故關(guān)于不同時(shí)間段的研究還具有局限性，還需要做進(jìn)一步的探究，本試驗(yàn)結(jié)果表明，柔嫩艾美耳球蟲HP基因與宿主細(xì)胞凋亡有關(guān)，且在其感染中期會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡，其中還會(huì)顯著誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的早期凋亡(P<0.01)。本次試驗(yàn)也將HP基因從此命名為柔嫩艾美耳球蟲凋亡誘導(dǎo)基因(IA)。