柳江楓，楊曄宏，武 樂，楊俊濤

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005

2南開大學統(tǒng)計與數(shù)據(jù)科學學院，天津 300071

衰老是存在于大多數(shù)生物體的復雜生物學過程，伴隨時間依賴性的功能衰退[1]。衰老和衰老相關疾病已為個體和社會帶來日益增長的負擔[2]。因衰老的進展機制復雜，至今尚不明確，所以一直缺少能夠有效延緩衰老的方案。生物組學技術在系統(tǒng)性研究復雜生物學過程中具備優(yōu)勢，并已應用于衰老研究領域[3]。既往研究表明，衰老過程伴隨基因組不穩(wěn)定、表觀遺傳改變、蛋白質穩(wěn)態(tài)丟失和代謝紊亂[1，4]。作為人和小鼠最大的代謝器官，肝臟在衰老過程中整體變化的研究資料尚不全面。衰老肝臟的生理學變化不明顯[5- 6]，但分子層面已發(fā)生特征性改變。既往與肝臟衰老相關的整體性組學研究大多涉及轉錄組學[7- 8]、DNA甲基化特征[9- 10]、單細胞測序[11]等領域，而蛋白質組學研究資料較少。本研究采用串聯(lián)質譜標簽(tandem mass tag，TMT)標記定量和液相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用技術，聯(lián)合比較了年輕與年老小鼠肝臟的蛋白質組學與乙酰化修飾蛋白質組學特征，以期為繼續(xù)深入開展衰老研究提供有效數(shù)據(jù)集。

材料和方法

實驗動物及分組野生型雄性C57BL/6J小鼠24只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，其中，2月齡小鼠14只(年輕組)，18月齡小鼠10只(年老組)。本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所實驗動物使用管理與倫理委員會批準，動物實驗倫理審查編號ACUC-A02- 2013- 001。

樣本前處理對小鼠實施安樂死后，稱取適量肝臟組織至預冷的研缽，在液氮環(huán)境將組織研磨成粉末。各樣本分別添加4倍于粉末體積的8 mol/L尿素裂解緩沖液，冰上超聲裂解。離心去除碎片，留上清液作為組織蛋白提取物，用BCA試劑盒(碧云天，P0011)測定蛋白質濃度。將每7只年輕小鼠的肝臟蛋白樣本混合成1個樣品，將每5只年老小鼠的肝臟蛋白樣本混合成1個樣品?；旌虾蟮?個樣品蛋白量相同，用于后續(xù)分析。

用胰酶(Promega，V5280)將各樣品從蛋白質酶解為肽段狀態(tài)。根據(jù)TMT試劑盒(Thermo Fisher Scientific，90068)的操作說明為各個樣品的肽段做TMT標記。標記后的肽段做高效液相色譜分離。用Agilent 300Extend C18(5 μm粒徑，4.6 mm內徑，250 mm長)色譜柱分離蛋白質組學分析的樣本，獲得9個組分。用Thermo Betasil C18(5 μm粒徑，10 mm內徑，250 mm長)色譜柱分離乙?；揎椀鞍踪|組學分析的樣本，獲得4個組分。將應用于乙酰化修飾分析的肽段與乙?；瘶渲?PTM Bio，PTM104)4 ℃共同孵育過夜。用0.1%三氟乙酸洗脫樹脂結合的肽段，留待乙?；揎椃治?。

液相色譜-質譜聯(lián)用分析采用EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)進行肽段分離。液相色譜流動相A相為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。設置40min液相梯度，流動相B從8%提升到80%，流速維持在400 nl/min。

超高效液相系統(tǒng)分離后的肽段被注入NSI離子源進行電離，然后進入Q ExactiveTMHF-X質譜儀進行串聯(lián)質譜分析。數(shù)據(jù)采集模式選擇數(shù)據(jù)依賴型分析(data-dependent analysis，DDA)模式，一級掃描選定的母離子進入HCD碰撞池進行碎裂，肽段母離子及其二級碎片高分辨率的Orbitrap質量分析器檢測。

數(shù)據(jù)庫搜索及生物信息分析質譜儀生成的原始raw文件用MaxQuant(1.5.2.8)進行檢索。數(shù)據(jù)庫文件選擇2019年6月24日下載并增添反庫和污染庫的Swiss-Prot小鼠蛋白質數(shù)據(jù)庫(17 014條序列)。數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)與質譜儀檢測參數(shù)保持一致。蛋白質組分析的漏切位點設為2，乙?；揎椀鞍踪|組分析的漏切位點設為4。肽段-譜圖匹配、蛋白質鑒定和修飾鑒定的假陽性率(false discovery rate，F(xiàn)DR)都設為1%。原始raw文件與MaxQuant搜庫結果都通過iProx[12]上傳至ProteomeXchange，并獲得PXD號：PXD018003。

MaxQuant生成蛋白質、修飾位點鑒定表后，過濾去除反庫、污染庫匹配到的條目，再以每個樣本的中值做數(shù)據(jù)質心化。用Perseus(1.6.5.0)軟件的Significance A算法做差異篩選，Benjamini-Hochberg FDR<0.05的蛋白質/位點設定為差異表達。用年老小鼠的均值比年輕小鼠的均值計算每個蛋白質/位點的變化倍數(shù)(fold-change，F(xiàn)C)，F(xiàn)C>1視為衰老過程中上調，F(xiàn)C<1視為衰老過程中下調。

采用通路分析(ingenuity pathway analysis，IPA)和基因本體(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫注釋蛋白質，功能富集分析由R包clusterProfiler[13]實現(xiàn)。層次聚類分析、主成分分析(principle component analysis，PCA)和圖像可視化由R實現(xiàn)。乙?；揎椢稽c的基序分析應用Motif-x算法實現(xiàn)。

結 果

年輕與年老小鼠的蛋白質組學整體特征描述蛋白質組學檢測共生成541 511張二級譜圖，其中，77 726張二級譜圖成功匹配到70 092條肽段(40 796條非重復肽段)，譜圖鑒定率為14.35%，結果良好。蛋白質組學共鑒定到5831個蛋白質，經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾篩選，4712個蛋白質可用于定量計算(圖1A)。肽段長度主要分布在7～53個氨基酸范圍內(圖1B)，提示胰酶酶切效果好。任意兩樣品間蛋白質整體定量的Pearson相關性系數(shù)≥0.99，提示檢測體系穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)滿足質量控制要求(圖1C)。用層次聚類分析與PCA評估各樣品整體特征，結果顯示年輕與年老小鼠肝臟蛋白質的整體表達模式有區(qū)別，且年老小鼠的肝臟蛋白表達量的變異程度略大于年輕小鼠(圖1D、E)。

A.蛋白質組的譜圖、肽段、蛋白質鑒定概況；B.蛋白質組全部肽段的長度分布柱狀圖；C.對蛋白質的定量值做log2轉換，繪制各樣品定量值的散點圖和密度分布圖，在圖上標注樣本間的Pearson相關性系數(shù)計算結果；D.年輕與年老小鼠肝臟蛋白質的層次聚類分析(4712個可定量蛋白，聚類距離=歐氏距離)；E.年輕與年老小鼠肝臟蛋白質的主成分分析A.identified spectra and peptides for proteins；B.length distribution of all the identified peptides in the proteome；C.scatter plot and density distribution based on log2(intensity)of quantified proteins，and Pearson correlation coefficients were calculated and displayed in the diagram；D.hierarchical clustering of proteins in livers of young and old mice(4712 quantifiable proteins were used，clustering distance=Euclidean distance)；E.principle component analysis of proteins in livers of young and old mice圖1 年輕與年老小鼠肝臟蛋白質組學整體概況Fig 1 Proteome profiling of livers in young and old mice

年輕與年老小鼠的差異表達蛋白質功能分析采用Perseus軟件的Significance A(雙邊，Benjamini-Hochberg FDR<0.05)算法計算差異表達蛋白質，結果顯示，衰老過程中小鼠肝臟有114個蛋白質表達量上調(上調>1.30倍)，81個蛋白質下調(下調<0.80倍)。采用IPA數(shù)據(jù)庫做亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)與整體相比，上調及下調的差異蛋白均出現(xiàn)了細胞核定位比例減少、細胞外基質定位比例增加的現(xiàn)象(圖2A)。功能富集分析顯示，衰老肝臟中上調的蛋白質主要與脂肪酸代謝、環(huán)氧合酶P450途徑、藥物分解代謝、有機羥基化合物代謝、花生四烯酸代謝等生物學過程相關(圖2B)；衰老肝臟中下調的蛋白質主要與基因沉默、核小體組裝、蛋白質異源四聚、干擾素反應等生物學過程相關(圖2C)。

GO_BP：基因本體_生物過程GO_BP：gene ontology_biological processA.蛋白質定位情況，總計4712個可定量蛋白，114個上調蛋白，81個下調蛋白；B.衰老時上調的蛋白質中富集程度最高的15個GO過程；C.衰老時下調的蛋白質中富集程度最高的15個GO過程A.location of the total，upregulated，and downregulated proteins；total：4712 quantifiable proteins，up：114 upregulated proteins in aged livers，down：81 downregulated proteins in aged livers；B.top 15 enriched GO processes by upregulated proteins during aging；C.top 15 enriched GO processes by downregulated proteins during aging圖2 衰老過程中小鼠肝臟的差異蛋白質功能分析Fig 2 Functions of differentially expressed proteins in livers of mice during normal aging

年輕與年老小鼠乙?；揎椀鞍踪|組學的整體特征乙?；揎椀鞍踪|組共生成146 519張二級譜圖，其中，18 601張二級譜圖成功匹配到13 808條肽段(對應1690個蛋白質)，譜圖鑒定率為12.7%。存在乙?；揎椀碾亩喂灿?3 606條(6626條非重復肽段)，對應1669個蛋白質和5640個乙?；揎椢稽c(圖3A)。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾篩選，4818個乙酰化位點(對應1367個蛋白質)可被量化并進行后續(xù)差異分析。肽段長度分布集中在7～38個氨基酸之間(圖3B)，樣品間Pearson相關性系數(shù)的最小值為0.98(圖3C)，提示乙?；揎椀鞍踪|組學數(shù)據(jù)的質量合格。采用層次聚類分析與PCA評估各樣品中可定量的乙?；揎椢稽c的整體狀況，結果顯示，年輕與年老小鼠肝臟的乙酰化位點表達有整體區(qū)別，且年老小鼠的肝臟乙?；揎椬儺惓潭嚷源笥谀贻p小鼠(圖3D、E)。

A.乙?；揎椀鞍踪|組的譜圖、肽段、蛋白質鑒定概況；B.乙?；揎椀鞍踪|組全部肽段的長度分布柱狀圖；C.對乙?；揎椢稽c的定量值做log2轉換，繪制各樣品定量值的散點圖和密度分布圖，在圖上標注樣本間的Pearson相關性系數(shù)計算結果；D.年輕與年老小鼠肝臟蛋白質乙?；稽c的層次聚類分析(4818可定量的乙?；稽c，聚類距離=歐氏距離)；E.年輕與年老小鼠肝臟蛋白質乙酰化位點的主成分分析A.identified spectra and peptides for acetylated proteins；B.length distribution of all the identified acetylated peptides；C.scatter plot and density distribution based on log2(intensity)of quantified acetylated sites，Pearson correlation coefficients were calculated and displayed in the diagram；D.hierarchical clustering of acetylated sites in livers of young and old mice(4818 quantifiable acetylated sites were used；clustering distance=Euclidean distance)；E.principle component analysis of acetylated sites in livers of young and old mice圖3 年輕與年老小鼠肝臟乙?；揎椀鞍踪|組學概況Fig 3 Acetylome profiling of livers in young and old mice

采用Motif-x算法分析肝臟乙酰化修飾位點的基序特征，發(fā)現(xiàn)在肝臟發(fā)生了乙?；揎椀牡鞍踪|中，酸性氨基酸，即天冬氨酸與谷氨酸出現(xiàn)在乙酰化修飾賴氨酸鄰近位置的頻率最高(圖4)。

圖4 小鼠肝臟乙?；揎椢稽c的基序分析Fig 4 Motifs of acetylated sites in mouse liver

年輕與年老小鼠中差異乙?；揎椀鞍椎墓δ芊治霾捎肧ignificance A(雙邊，Benjamini-Hochberg FDR<0.05)算法計算差異表達的乙?；稽c，結果顯示，衰老過程中小鼠肝臟有60個乙酰化位點(位于39個蛋白質中)上調(上調>1.69倍)，53個乙?；稽c(位于38個蛋白質中)下調(下調<0.63倍)。IPA定位分析顯示，與定量蛋白質組學相比，乙酰化修飾蛋白質定位于細胞質的比例明顯增加(圖5A)。與全部乙?；揎椀鞍踪|相比，表達差異乙酰化位點的蛋白質定位于細胞核的比例有所下降，定位于細胞外基質的比例有所增加(圖5A)。功能富集分析顯示，具有上調乙?；稽c的39個蛋白質，與輔因子代謝、小分子分解代謝、磷酸核糖代謝、核糖核苷酸代謝、嘌呤代謝等生物學過程相關(圖5B)；含下調乙?；稽c的38個蛋白質，主要與含硫化合物代謝、未折疊蛋白反應、氨基酸代謝等生物學過程相關(圖5C)。

蛋白質組學與乙?；揎椀鞍踪|組學的功能范圍比較蛋白質組學與乙?；揎椀鞍踪|組學共同鑒定到1262個蛋白質，只被蛋白質組學鑒定到而不被乙?；揎椀牡鞍子?450個；只能在乙?；患蟊昏b定到的蛋白質有105個(圖6A)。功能富集分析顯示，能被總蛋白質組鑒定而不發(fā)生乙?；牡鞍踪|主要與高爾基體囊泡轉運、mRNA加工、內膜系統(tǒng)組裝、蛋白質在細胞器的定位和RNA剪接相關(圖6B)；能被總蛋白質組鑒定且發(fā)生乙?；牡鞍踪|，主要與輔因子代謝、小分子分解代謝、氨基酸代謝、組織酸分解代謝和羧酸分解代謝過程相關(圖6C)；只能在乙酰化富集后被鑒定到的105種蛋白質，主要與蛋白質乙?；磅；⒌鞍踪|-DNA復合物組裝、組蛋白修飾和共價染色質修飾相關(圖6D)。

A.韋恩圖展示蛋白質組鑒定到的全部可定量蛋白質與乙?；揎椀鞍踪|組鑒定到的全部蛋白質的匹配情況；B.僅被蛋白質組鑒定到的3450個蛋白質中富集程度最高的5個GO過程；C.同時被蛋白質組和乙?；揎椀鞍踪|組鑒定到的1262個蛋白質中富集程度最高的5個GO過程；D.僅被乙?；揎椀鞍踪|組鑒定到的105個蛋白質中富集程度最高的5個GO過程A.Venn diagram of all quantifiable proteins in the proteome and all acetylated proteins in the acetylome；B.top 5 enriched GO processes by the 3450 proteins only identified in the proteome；C.top 5 enriched GO processes by the 1 262 proteins identified in both the proteome and acetylome；D.top 5 enriched GO processes by the 105 proteins only identified in the acetylome圖6 蛋白質組學與乙酰化修飾蛋白質組學所鑒定蛋白的功能異同F(xiàn)ig 6 Comparison of biological functions between proteome and acetylome in livers

討 論

本研究采用TMT標記定量與液質聯(lián)用技術聯(lián)合檢測生理狀態(tài)下年輕與年老雄性C57BL/6J小鼠肝臟的蛋白質組學與乙?；揎椀鞍踪|組學，為衰老研究提供了可資參考的有效數(shù)據(jù)集。年輕與年老小鼠的蛋白質組與乙?；揎椀鞍踪|組的整體表達模式有區(qū)別，但差異較小。本研究與既往自然衰老相關的小鼠多器官蛋白質組學[14]和肝臟轉錄組學[7]研究結果共同表明，衰老過程中生物大分子的整體表達雖然有所變化，但這種變化并不劇烈。

乙?；且环N可以將生理過程與基因調控耦聯(lián)起來的蛋白質翻譯后修飾[15]，對細胞內代謝改變敏感，代謝過程產生的乙酰輔酶A是乙?；揎椀奶荚碵16]。乙酰化位點的表達水平一定程度上受該位點所在蛋白質表達水平的影響。但不同批次的質譜檢測結果之間獨立性較強，所以蛋白質組學與乙?；揎椀鞍踪|組學的定量研究分開進行。在小鼠肝臟衰老過程中，蛋白質組鑒定到的上調蛋白質主要與脂肪酸代謝、環(huán)氧合酶P450途徑、藥物分解代謝、有機羥基化合物代謝、花生四烯酸代謝等代謝過程相關；衰老肝臟下調的蛋白質包含組蛋白，主要與基因沉默、核小體組裝、蛋白質異源四聚、干擾素反應、蛋白質-DNA復合物組裝等生物學過程相關。本研究發(fā)現(xiàn)，乙?；蛴谛揎棿x過程相關的蛋白質且廣泛存在于組蛋白中，可能調節(jié)代謝功能和染色質組裝[1，4]。

在做液相色譜-質譜檢測前，本研究對提取的蛋白質做了等量混合處理。樣本混合可以有效減少因個體差異較大導致的數(shù)據(jù)離散，但也對應用經(jīng)典的雙樣本t檢驗做差異篩選帶來限制。Significance A算法可用于分析每組有2個生物學重復的比較組，因此被應用于本研究[17]。本研究選擇TMT標記作為定量方法，與非標記定量相比，在蛋白質酶解后即引進TMT標記可減少后續(xù)檢測步驟引起的系統(tǒng)誤差，各樣本定量更準確。但TMT標記同時會導致差異幅度被壓縮和修飾解析復雜性增強的問題[18]。TMT定量方法不能測定特異性存在于年輕小鼠或特異性存在于年老小鼠的肽段、蛋白質或修飾位點，因為只有同時存在于每個樣本的肽段才能被檢測到。TMT的技術特點導致獲取的差異蛋白質和乙?；揎椢稽c數(shù)目較少，但也相應排除了大量干擾測定的因素，使鑒定結果更注重整體趨勢變化。技術方法與統(tǒng)計分析方法進步將進一步提升衰老相關研究的數(shù)據(jù)容量與質量。整合不同年齡、性別、器官的多維度數(shù)據(jù)也將幫助人們規(guī)避測量偏差[19]，全面認識衰老過程。

綜上，本研究為衰老相關機制研究和干預方法探索提供了蛋白質組學與乙?；揎椀鞍踪|組學的較為完善的數(shù)據(jù)集。