武 磊，周文勤，袁琳楠，李 潔，裴美麗

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061 2西安市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710003 3商南縣中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西商洛 726300 4西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，西安 710061

卵巢癌是婦科惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一，因其組織來(lái)源及結(jié)構(gòu)復(fù)雜、位置較深，不易被表面觸及，約80%的患者確診時(shí)即為中晚期，且多數(shù)已有盆腔各器官及腹腔大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移，5年生存率多年來(lái)徘徊在30%左右。雖然分子靶向研究聯(lián)合臨床試驗(yàn)取得了很大進(jìn)展，如聚ADP核糖聚合酶抑制劑(poly ADP-ribose polymerase inhibitor，PARPi)已應(yīng)用于晚期上皮性卵巢癌的維持治療，可顯著延長(zhǎng)患者無(wú)進(jìn)展生存期[1]，但卵巢癌仍嚴(yán)重威脅著婦女的生命安全，其總體生存率亟待進(jìn)一步提高。miR- 145是新近研究比較明確的抑癌基因，研究顯示其能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[2]、耐藥[3]和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)[4]等生物進(jìn)程，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。根據(jù)TargetScan軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)腺苷5’-磷酸(amp)激活蛋白激酶-相關(guān)蛋白激酶- 5[adenosine 5’-monophosphate(amp)activates protein kinase-related protein kinase 5，ARK5]是miR- 145的靶基因之一。ARK5又稱(chēng)NUAK1，屬于腺苷5’-磷酸(amp)激活蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate(amp)activates protein kinase，AMPK]亞家族成員，多項(xiàng)研究顯示，ARK5對(duì)于癌癥患者的生存至關(guān)重要，在不同類(lèi)型的癌癥中，ARK5表達(dá)升高與細(xì)胞惡性行為呈正相關(guān)，包括化療耐藥、早期轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后[5- 8]。本研究探討了miR- 145- 5p對(duì)人上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能涉及的分子機(jī)制，以期為阻止卵巢癌的發(fā)展進(jìn)程提供新的研究思路。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系和試劑人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3為西安交通大學(xué)機(jī)能細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)，人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，RPMI- 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，細(xì)胞消化胰酶、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，miR- 145- 5p mimic(模擬物)、control(mimic NC 模擬物陰性對(duì)照)購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa試劑公司，CCK- 8試劑盒購(gòu)自西安鼎國(guó)商貿(mào)有限責(zé)任公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。ARK5抗兔多克隆單抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin抗兔克隆單抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，二抗購(gòu)自北京天德悅生物技術(shù)有限公司；PVDF膜及底物發(fā)光液均購(gòu)自美國(guó)millipore公司。

細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3用含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI- 1640培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2、CM2- 1培養(yǎng)液。CM2- 1培養(yǎng)液為90% RPMI- 1640+10% FBS。RPMI- 1640為含谷氨酰胺的1640培養(yǎng)液。

細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度60%，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將miR- 145- 5p mimic與miR-control分組轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)內(nèi)避光操作。轉(zhuǎn)染48 h后提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行分析。

qRT-PCR檢測(cè)將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)并做相應(yīng)處理，采用Trizol法按實(shí)驗(yàn)步驟提取細(xì)胞中的總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，當(dāng)A260/A280值介于1.8～2.0間時(shí)可進(jìn)一步行RNA反轉(zhuǎn)錄。采用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl，將RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA用滅菌ddH2O稀釋10倍，mRNA按以下反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：SYBY Green 10 μl，上游引物 0.4 μl，下游引物 0.4 μl，cDNA模板4.0 μl，ddH2O 5.2 μl，總體積 20.0 μl。對(duì)miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，考慮到含量本身較少，cDNA不稀釋?zhuān)匆韵路磻?yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)：SYBY Green 10 μl，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl，cDNA模板4.0 μl，ddH2O 4.4 μl，總體積20.0 μl。mRNA的反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每一個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)定量(relative quantification，RQ)值，取平均值。miRNA的反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，50 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每一個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算RQ值，取平均值。

2-ΔΔCt法：(1)用內(nèi)參基因的CT值(樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的熒光閾值時(shí)需要的循環(huán)數(shù))歸一目標(biāo)基因的CT值：(2)ΔCT(test)=CT(target，test)-CT(ref，test)，ΔCT(calibrator)=CT(target，calibrator)-CT(ref，calibrator)；(3)用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一實(shí)驗(yàn)樣本的ΔCT 值：ΔΔCT=ΔCT(test)-ΔCT(calibrator)；(4)計(jì)算表達(dá)水平比率：2-ΔΔCT=表達(dá)量的比值。

引物序列：(1)miR- 145- 5p：F：5’-GTCCAGTTTTCCCAGGAF- 3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTF- 3’；(2)U6：F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT- 3’，R：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC- 3’；(3)β-actin：F：5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA- 3’，R：5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG- 3’；(4)ARK5：F：5’-GAGTCCACTCTATGCAT- 3’，R：5’-ATGTCCTCAATAGTGGCC- 3’；(5)miR- 145- 5p：RT primer：5’-CGTATCCAGTGCAGGGT-CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGAT- 3’；(6)U6：RT primer：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA- 3’。

靶基因預(yù)測(cè)和篩選用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan(http：/www.TargetScan.org/)預(yù)測(cè)miR- 145的靶基因，統(tǒng)計(jì)靶基因個(gè)數(shù)，列出權(quán)重分?jǐn)?shù)絕對(duì)值高于0.50的進(jìn)行篩選，結(jié)合文獻(xiàn)選取其中與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的ARK5基因進(jìn)行下一步研究。

CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖采用CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，具體為：將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞調(diào)整至5×103個(gè)/孔均勻鋪于96孔板中，培養(yǎng)液100 μl/孔，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。24 h后換含10μl CCK- 8的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值。增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD-對(duì)照組OD)/對(duì)照組OD×100%。

Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基終止消化，按說(shuō)明書(shū)收集細(xì)胞，加入300 μl的1×Binding Buffer(緩沖液)懸浮細(xì)胞。加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl的PI染色，室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)上機(jī)。

Western blot檢測(cè)IOSE80(或SKOV3)細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，24 h貼壁后分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，待細(xì)胞處理到檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加入RIPA 裂解液150 μl、PI 6 μl、PMSF 3 μl，冰上孵育30 min，每隔5 min晃動(dòng)1次；移入離心管中，4 ℃、12 000 g 離心15 min，上清液即為總蛋白質(zhì)；吸取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)濃度計(jì)算加樣體積，加等體積的2×電泳加樣緩沖液，沸水浴5～10 min，每孔上樣量保持一致。電泳(80 V/30 min，120 V/70 min)，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(200 mA/60 min)。5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜10 min 3次；一抗孵育4 ℃過(guò)夜，洗膜10 min 3次；二抗孵育室溫2 h，最后洗膜10 min 3次，滴上發(fā)光液顯色。

雙熒光素酶基因驗(yàn)證報(bào)告實(shí)驗(yàn)采用雙熒光素酶基因驗(yàn)證報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR- 145- 5p與ARK5的相互作用關(guān)系，ARK5 mRNA的野生型全長(zhǎng)3’-UTR以及突變型3’-UTR擴(kuò)增并連接到psi-CHECK- 2載體(美國(guó)Promega公司)，分別命名為野生型WT-ARK5 psiCHECKTM- 2 載體組和突變型MT-ARK5 psiCHECKTM- 2載體組。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染200 nmol/L miR- 145- 5p mimic和100 ng質(zhì)粒，24孔板培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞裂解，海腎和螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光強(qiáng)度使用Dual-Luciferase報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)，柱狀圖及生長(zhǎng)曲線(xiàn)用Graphpad軟件繪制，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

miR- 145在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)降低根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)說(shuō)明，常規(guī)復(fù)蘇并培養(yǎng)SKOV3和IOSE80兩個(gè)細(xì)胞系，qRT-PCR法檢測(cè)miR- 145- 5p的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR- 145- 5p在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常人卵巢上皮細(xì)胞IOSE80(5.347±1.485比9.813±0.242；t=4.345，P=0.049)。

轉(zhuǎn)染miR- 145- 5p mimic可以促進(jìn)SKOV3細(xì)胞中miR- 145- 5p的表達(dá)以miR- 145- 5p mimic及control轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，達(dá)到作用時(shí)間點(diǎn)時(shí)提取細(xì)胞的總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，miR- 145- 5p mimic組細(xì)胞的miR- 145- 5p表達(dá)量明顯高于control組(2594.000±58.620比0.993±0.115；t=76.640，P=0.002)，control組與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.993±0.115比1.000±0.001；t=1.008，P=0.419)。

過(guò)表達(dá)miR- 145- 5p可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡CCK- 8檢測(cè)結(jié)果顯示，miR- 145- 5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖率明顯低于control組[(48.580±5.392)%比(98.140±0.699)%；t=-15.790，P<0.001]，而control組與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(98.140±0.699)% 比(99.100±0.890)%；t=1.786，P=0.216]；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR- 145- 5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率明顯高于control組[(47.270±4.027)% 比(29.980±1.715)%；t=5.433，P=0.032](圖1)。

圖1 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示miR- 145- 5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率高于control組Fig 1 The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of the miR- 145- 5p overexpression group was higher than that of the control group

ARK5是miR- 145- 5p的靶基因TargetScan在線(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ARK5 3’-UTR上存在潛在的與 miR- 145- 5p靶向結(jié)合的位點(diǎn)(圖2)。檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR- 145- 5p及control細(xì)胞中ARK5的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR- 145- 5p可以下調(diào)細(xì)胞中ARK5的mRNA表達(dá)水平(0.460±0.065比1.000±0.010；t=-12.824，P<0.001)及蛋白表達(dá)水平(0.310±0.085比 0.670±0.102；t=-4.792，P=0.001)(圖3)。根據(jù)ARK5互補(bǔ)序列構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒(圖4)，進(jìn)一步進(jìn)行雙熒光素酶基因驗(yàn)證報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示：miR- 145- 5p mimic+ARK5-WT組細(xì)胞的熒光素酶活性(0.461±0.132)明顯低于共轉(zhuǎn)染mimic control的NC組(1.020± 0.030；t=-6.421，P=0.016)和ARK5-WT 3’UTR組細(xì)胞(1.003±0.670；t=-5.383，P=0.010)，而miR- 145- 5p mimic+ARK5-MUT組細(xì)胞與NC+ARK5-MUT組細(xì)胞的酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.003±0.670比1.020±0.030；t=1.145，P=0.082)。

圖2 ARK5 3’-UTR上潛在的與miR- 145- 5p靶向結(jié)合的位點(diǎn)Fig 2 Potential binding site of miR- 145- 5p with ARK5 3’-UTR

圖3 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR- 145- 5p可以下調(diào)細(xì)胞中ARK5蛋白的表達(dá)水平Fig 3 Western blot showed that overexpression of miR- 145- 5p can down-regulate the protein level of ARK5 in cells

圖4 人ARK5 3’-UTR、miR- 145- 5p和pMIR-REPORT熒光素酶質(zhì)粒的生物學(xué)信息Fig 4 Biological information of human ARK5 3’-UTR，miR- 145- 5p，and pMIR-REPORT luciferase plasmid

過(guò)表達(dá)ARK5可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡克隆ARK5全部序列構(gòu)建GV219(+)載體，合成促ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，然后將ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空載體vector分別轉(zhuǎn)染入SKOV3細(xì)胞中，qPT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞中的ARK5 mRNA表達(dá)水平(432.500±10.001比0.993±0.115；t=74.820，P<0.001)和蛋白表達(dá)水平(6.260± 0.420比0.930 ± 0.180；t=6.397，P=0.003)均明顯高于vector轉(zhuǎn)染組(圖5)。CCK- 8檢測(cè)結(jié)果顯示，在同一細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h之后，ARK5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖率明顯高于vector轉(zhuǎn)染組[(41.601±4.341)% 比(18.960±5.394)%；t=27.290，P<0.001]，vector轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(18.960±5.394)%比(16.120±1.642)%；t=1.786，P=0.216]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，ARK5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的24 h凋亡率明顯低于vector轉(zhuǎn)染組 [(13.740±1.010)%比(29.320±0.210)%；t=-8.241，P=0.001](圖6)。

圖5 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞中的ARK5蛋白表達(dá)水平高于vector轉(zhuǎn)染組Fig 5 Western blotting showed that the protein level of ARK5 in the SKOV3 cells transfected with ARK5 overexpression vector was higher than that in the cells transfected with the blank vector

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示vector轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的24 h凋亡率高于ARK5過(guò)表達(dá)組Fig 6 The results of flow cytometry showed that the 24 h apoptosis rate of the cells transfected with the blank vector was higher than that of the cells transfected with ARK5 overexpression vector

miR- 145- 5p靶向ARK5可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡將SKOV3細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、miR- 145 mimic組和miR- 145 mimic+ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組，分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，CCK- 8檢測(cè)結(jié)果顯示，miR- 145 mimic組細(xì)胞的增殖活性明顯低于陰性對(duì)照組[(47.580±5.392)% 比(97.201±0.699)%；t=-14.490，P=0.003]，miR- 145 mimic+ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組明顯高于miR- 145 mimic組[(99.430±0.545%)%比(47.580±5.392)%；t=15.580，P=0.004]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR- 145 mimic組細(xì)胞的凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組[(37.020±0.201)%比(26.160±1.010)%；t=6.455，P=0.023]，miR- 145 mimic+ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組明顯低于miR- 145 mimic組[(23.620±0.910)%比(37.020±0.210)%；t=-12.470，P=0.006](圖7)。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示miR- 145 mimic組細(xì)胞的凋亡率高于陰性對(duì)照組，miR- 145 mimic+ARK5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組低于miR- 145 mimic組Fig 7 The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of the miR- 145 mimic group was higher than that of the negative control group and the miR- 145 mimic + ARK5 overexpression plasmid group

討 論

卵巢癌是女性與癌癥相關(guān)死亡的第5大誘因，居?jì)D科惡性腫瘤死因首位，也是40歲以上女性中僅次于乳腺癌的常見(jiàn)惡性腫瘤，尤其是在發(fā)達(dá)國(guó)家。全球每年約有24萬(wàn)新診斷卵巢癌患者[9]。因卵巢癌早期癥狀不明顯，患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)入中晚期[10- 11]。在診斷為晚期(FIGO Ⅲ或Ⅳ期)浸潤(rùn)性上皮性卵巢癌的女性中，5年存活率不足50%[12]，且復(fù)發(fā)率極高。因此，積極探索卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，尋求更加有效的治療方案，是目前亟需解決的問(wèn)題。

miRNAs是不編碼蛋白質(zhì)的小單鏈RNA，在真核生物中廣泛存在，通過(guò)與靶癌基因序列互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)揮沉默靶癌基因或抑制其表達(dá)的作用[13]。miRNAs可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、應(yīng)激等生物進(jìn)程[14]，還與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控密切相關(guān)，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。miR- 145被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)[16- 20]，是人體的保護(hù)基因，承擔(dān)著維護(hù)機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的角色。鑒于對(duì)miR- 145作用機(jī)制的了解，本研究旨在探討miR- 145- 5p在上皮性卵巢癌(最常見(jiàn)的卵巢癌組織類(lèi)型，發(fā)病率占卵巢癌85%～90%)細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及可能涉及的分子機(jī)制。

本研究首先通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miR- 145- 5p在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于正常卵巢上皮細(xì)胞，與其他腫瘤組織中結(jié)果一致，發(fā)揮抑癌作用。CCK- 8及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，miR- 145- 5p可抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。為了研究miR- 145- 5p抑制卵巢癌的作用機(jī)制，本研究采用TargetScan軟件在互聯(lián)網(wǎng)上預(yù)測(cè)其潛在的靶基因，發(fā)現(xiàn)并通過(guò)分子交互實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其在卵巢癌中的直接分子靶標(biāo)ARK5。ARK5與癌細(xì)胞之間的關(guān)系已在許多癌癥類(lèi)型中得到驗(yàn)證，如膽管癌[21]、肝癌[22]和鼻咽癌[23]。ARK5可以多種方式參與癌癥的發(fā)展和進(jìn)程：ARK5是Akt信號(hào)通路上的分子，AKT磷酸化可以通過(guò)激活A(yù)RK5抑制凋亡來(lái)刺激癌細(xì)胞的入侵活動(dòng)[24]；Chang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，ARK5可增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)- 2和MMP- 9表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移。ARK5還可通過(guò)核因子κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)參與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，維持癌細(xì)胞的存活[26]。Phippen等[27]研究表明，ARK5通過(guò)促進(jìn)EMT和激活絲氨酸/蘇氨酸激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/基質(zhì)金屬蛋白酶途徑來(lái)增加SKOV3細(xì)胞侵襲潛能。另有研究發(fā)現(xiàn)，ARK5與卵巢癌的預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)水平越高，卵巢癌患者的預(yù)后越差[28]。此外，ARK5還抵抗凋亡、激活癌細(xì)胞缺氧耐受以及調(diào)節(jié)信號(hào)通路。本研究進(jìn)一步通過(guò)ARK5對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及miR- 145- 5p和ARK5兩者相互作用的相關(guān)研究，明確了miR- 145- 5p可通過(guò)靶向ARK5抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

綜上，本研究結(jié)果顯示，miR- 145- 5p可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，而ARK5發(fā)揮與其相反的作用。本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)和分子交互實(shí)驗(yàn)證實(shí)ARK5是miR-145的靶基因，受miR-145的直接調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-145也受到上游非編碼RNA的調(diào)控。如：預(yù)示卵巢癌不良預(yù)后的環(huán)狀RNA Hsa_circ_0009910，就是通過(guò)抑制miR- 145來(lái)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞增殖性和活動(dòng)性表型[29]；LncRNA SNHG1通過(guò)抑制miR- 145- 5p促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生[30]。且ARK5也可影響細(xì)胞侵襲、遷移、EMT進(jìn)程等，至于miR- 145- 5p的上游分子以及其靶向ARK5作用于下游的哪個(gè)分子以及途徑，本研究未做深入探討，尚待進(jìn)一步研究。