武彩霞 馬曉茜 唐敏芳 于宗琴 李婭寧 霍連廣

匹諾塞林是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的一種新型腦保護(hù)新藥,屬于黃酮類(lèi)化合物,蜂膠中含量較高。已有多項(xiàng)研究資料證明,匹諾塞林有抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管舒張等多方面藥理作用［1-6］,能減輕腦缺血再灌注損傷［7］,但其作用靶點(diǎn)仍然不清楚。為進(jìn)一步探討匹諾塞林腦保護(hù)的作用機(jī)制,為尋找其作用靶點(diǎn)提供啟示,本文用缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷SHSY5Y 細(xì)胞模擬腦缺血再灌注損傷模型,觀察匹諾塞林對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子［Ca2+］i 變化及Caspase-12 表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 匹諾塞林凍干粉,批號(hào) 201804；SH-SY5Y 細(xì)胞株,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所提供；DMEM/F12 培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,Gibco 公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、Sigma 公司產(chǎn)品；鈣離子熒光探針Furo 4-AM,Invitrogin 公司產(chǎn)品；Caspase-12(SC-5627)一抗,美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品,Dylight651-conjugated 熒光二抗：美國(guó)CST 公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與設(shè)備 細(xì)胞孵育箱,日本三洋公司；高內(nèi)涵細(xì)胞成像儀,英國(guó)Thermo Fisher 公司；超凈純水儀,美國(guó)Beckman 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12 基質(zhì)中培養(yǎng),每2～3 天換液1 次。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)時(shí),加0.25%胰蛋白酶消化,200 μl/孔(5000 個(gè)/孔)接種在96 孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h 后,更換無(wú)糖EBSS 平衡鹽溶液(154 NaCl,5.6 KCl,5.0 HEPES,3.6 NaHCO3,2.3 CaCl2,pH 7.4；單位mmol/L)［8］,隨機(jī)分為OGD/R 組及匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組,OGD/R 組不加任何藥物；匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組調(diào)整終濃度分別為0.01、0.10、1.00 μM。三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2,1%O2,94%N2；培養(yǎng)2 h 后,移除培養(yǎng)液,更換完全培養(yǎng)基,復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2,飽和濕度下培養(yǎng)12 h。對(duì)照組更換完全培養(yǎng)基,正常條件下培養(yǎng)。

1.3.2 匹諾塞林對(duì)細(xì)胞Caspase-12 表達(dá)的影響 根據(jù)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果(另文發(fā)表),高內(nèi)涵成像分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達(dá)的變化。

上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后,用預(yù)溫的PBS 洗滌細(xì)胞3 次,37℃條件下,4%多聚甲醛100 μl 固定20 min。吸除固定液,PBS 再洗滌3 次,用0.5% Triton X-100/PBS 100 μl 室溫條件下孵育10 min 后,PBS 再洗滌3 次；用含2%胎牛血清的PBS 37℃孵育60 min,吸除,加入一抗50 μl(1∶200 稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；吸除一抗,PBS洗滌3 次后,加入Dylight651-conjugated 熒光二抗50 μl(1∶200 稀釋)避光孵育2 h(37℃)；吸除二抗,PBS 洗滌2 次,棄去上清,最后加入PBS 200 μl 于高內(nèi)涵成像儀拍照分析。

1.3.3 匹諾塞林對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響 預(yù)先用0.01%多聚賴(lài)氨酸包被96 孔板,按前述方法接種細(xì)胞。除去培養(yǎng)基,使用HBSS 溶液洗滌細(xì)胞3 次。每孔加入Fluo 4-AM 工作液(用HBSS 溶液稀釋配制,濃度5 μM)50 μl,37℃孵育30min。用HBSS 溶液洗滌細(xì)胞3 次,每孔加入100 μl HBSS 溶液,高內(nèi)涵成像儀拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用單因素方差分析(one-wayanalysis of variance,ANOVA)進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)比較。結(jié)合Student-Newman-Keuls 檢驗(yàn),P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 匹諾塞林對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,OGD/R 組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達(dá)顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD/R 組比較,匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達(dá)均降低,其中匹諾塞林中劑量組、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達(dá)均低于OGD/R 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 匹諾塞林對(duì)OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達(dá)的影響

2.2 匹諾塞林對(duì)OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響與對(duì)照組比較,OGD/R 組細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i 顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與OGD/R 組比較,匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i均下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 匹諾塞林對(duì)OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i 的影響

3 討論

SH-SY5Y 細(xì)胞株來(lái)源于人類(lèi)胚胎中腦,其細(xì)胞形態(tài)、生理生化功能與正常神經(jīng)元相似［9］。通過(guò)缺糖缺氧后快速恢復(fù)氧糖供應(yīng)損傷SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞,可在細(xì)胞水平模擬臨床腦缺血再灌注損傷,進(jìn)行細(xì)胞機(jī)制和藥物研究［10-12］。在本實(shí)驗(yàn)中,采用OGD/R 損傷的SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞模型,證實(shí)匹諾塞林可以減輕OGD/R 造成的［Ca2+］i 升高及Caspase-12 表達(dá)增加。

關(guān)于匹諾塞林,已有大量資料證實(shí)其可以減輕腦缺血再灌注損傷［7］。關(guān)于腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制非常復(fù)雜,近些年來(lái),腦缺血再灌注時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡通路引起廣泛關(guān)注［13,14］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡主要有三條途徑：Caspase-12 的激活、CHOP/GADD153 轉(zhuǎn)錄激活及c-jun 氨基末端激酶(JNK)誘導(dǎo)凋亡［15］。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí),OGD/R 損傷SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞,可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生,細(xì)胞凋亡增加,匹諾塞林可以減少CHOP/GADD153 表達(dá),減少細(xì)胞凋亡(該研究結(jié)果另文發(fā)表),本研究繼續(xù)探討對(duì)Caspase-12 的影響。

Caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種特異性蛋白酶,其表達(dá)水平的高低直接反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。通常Caspase-12 主要以無(wú)活性的前體形式存在,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)活化［16］,活化的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入到細(xì)胞漿中作用于Caspase-9,激活Caspase-3 引起細(xì)胞凋亡［17,18］。匹諾塞林能下調(diào)OGD/R損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞Caspase-12 的表達(dá),這可能是也是其抗凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

研究表明,細(xì)胞內(nèi)Ca2+可能是主動(dòng)調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因素,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高參與了細(xì)胞凋亡早期的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存細(xì)胞內(nèi)80%～90%Ca2+,腦缺血再灌注時(shí),引發(fā)細(xì)胞凋亡的多種刺激因素均可使Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放,造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著增加［19］,繼而引起線粒體通透孔的開(kāi)放,導(dǎo)致線粒體腫脹、線粒體內(nèi)Ca2+超載,最終導(dǎo)致線粒體外膜破裂；同時(shí)釋放的Ca2+還可以激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、鈣蛋白酶、死亡相關(guān)蛋白酶和其相關(guān)的線粒體分裂融合蛋白,促使細(xì)胞色素C 釋放,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此細(xì)胞凋亡的線粒體相關(guān)信號(hào)途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)功能及［Ca2+］i 密切相關(guān)［20,21］。

由上可知,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的耗竭是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要原因,相反,阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+外流可以促進(jìn)細(xì)胞生存［22］。還有學(xué)者認(rèn)為,Caspase-12的活化也與細(xì)胞Ca2+平衡失調(diào)有關(guān)［17］。在本實(shí)驗(yàn)中,匹諾塞林降低細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i,聯(lián)系本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果——匹諾塞林能保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能［23-25］,推測(cè)匹諾賽林可能在腦缺血再灌注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常結(jié)構(gòu)和功能有幫助,而這可能是其線粒體保護(hù)作用的上游事件。此外,匹諾塞林下調(diào)Caspase-12 表達(dá),也可能與其降低細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i 有關(guān)。但是,對(duì)于OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞后,匹諾塞林降低細(xì)胞內(nèi)鈣的具體機(jī)制是什么,還需要更加深入的探討。