馬曉荷，汪敏，朱磊，郭見(jiàn)多，李清越，劉婷，翟杜娟，孫成松，張世清，汪天平

安徽省血吸蟲(chóng)病防治研究所，安徽 合肥 230601

血吸蟲(chóng)病是由裂體吸蟲(chóng)屬吸蟲(chóng)感染引起的寄生蟲(chóng)病，該病嚴(yán)重危害人類健康,阻礙經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展,主要分布在非洲、亞洲和拉丁美洲，是全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。感染人類的血吸蟲(chóng)之中，中國(guó)只存在日本血吸蟲(chóng)[1,3]。安徽省日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)類型以湖沼型為主[4-6]，還包括洲灘型和山丘型。

在地理隔離[7-8]、終宿主差異[9]等因素的影響下，血吸蟲(chóng)個(gè)體會(huì)產(chǎn)生遺傳變異。線粒體DNA(mtDNA)是寄生蟲(chóng)群體遺傳研究中具有較好價(jià)值的遺傳標(biāo)志[10]。單個(gè)個(gè)體內(nèi)mtDNA有高度均一性，遵循嚴(yán)格的母系遺傳方式，具有進(jìn)化速度快、群體內(nèi)變異大、近緣種間解釋的靈敏度高等特點(diǎn)，利于進(jìn)行群體遺傳分析。為了解安徽省不同地區(qū)日本血吸蟲(chóng)群體間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本文通過(guò)測(cè)定并分析安徽省不同類型流行區(qū)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的線粒體NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)脫氫酶1(ND1)和細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，探討安徽省不同類型血吸蟲(chóng)病流行區(qū)日本血吸蟲(chóng)群體間的進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 采集安徽省山丘型流行區(qū)(池州市石臺(tái)縣)和湖沼型流行區(qū)(安慶市大觀區(qū)、銅陵市樅陽(yáng)縣)的釘螺，逸蚴篩選陽(yáng)性釘螺并繼續(xù)飼養(yǎng)。兩周后對(duì)釘螺進(jìn)行再次逸蚴，收集尾蚴感染BALB/c小鼠(雌性，6～7周)，35天后解剖小鼠，門靜脈灌注法分離和收集成蟲(chóng)，單只成蟲(chóng)分別收集于含有95%乙醇的1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。

1.2方法

1.2.1日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)DNA提取 每只成蟲(chóng)用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO44.3 mmol/L，KH2PO41.4 mmol/L)洗滌3次，去除雜質(zhì)和95%乙醇。用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒(Qiagen，德國(guó))提取DNA，具體操作流程參照說(shuō)明書，不同地區(qū)的血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)DNA單獨(dú)提取。

1.2.2ND1和COⅠ基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序 以GenBank中日本血吸蟲(chóng)線粒體基因組序列NC_002544.1中COⅠ基因編碼序列和ND1基因編碼序列為模板設(shè)計(jì)引物。參考序列COⅠ基因長(zhǎng)度為1 527 bp，正向引物5'-GATTTGATATCTTGATTTGTCT-3'，反向引物5'-CTAATACTTTGATCAATTCTTACCG-3'；ND1基因長(zhǎng)度為891 bp，正向引物5'-ATGAATATATGAAACTTTTTAG-3'，反向引物5'-CTACCTTATAATTATAATCAATCCG-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積50 μL，ND1擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min；COⅠ擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3ND1和COⅠ基因克隆和測(cè)序 用膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物連接至pESI-T載體(上海翊圣生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組陽(yáng)性克隆。將鑒定成功的克隆子送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 利用Chromas軟件查看測(cè)序峰圖，手工篩查每條序列的測(cè)序結(jié)果。利用Clustal X 2.0[11]比對(duì)序列，使用DNAsp 6.0[12]和Mega X[13]分析序列的基本特征。在Mega X中以COⅠ和ND1序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，外群(outgroup)分別為曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosomamansoni)的COⅠ和ND1序列，序列來(lái)源為GenBank中曼氏血吸蟲(chóng)線粒體全基因組序列，序列號(hào)為NC_002545.1。建樹(shù)方法為鄰接法(Neighbor-Joining Method)，自展值(bootstrap)為1 000，樣本間進(jìn)化距離計(jì)算方法為Kimura 2-parameter 算法。

2 結(jié) 果

2.1ND1和COⅠ基因序列多態(tài)性分析 本研究中所有樣品擴(kuò)增獲得的條帶大小均與預(yù)期一致，截去首尾部分序列后用于分析的ND1和COⅠ基因序列長(zhǎng)度分別為844 bp和1 481 bp。ND1基因序列存在15個(gè)變異位點(diǎn)，G+C含量為0.298，堿基轉(zhuǎn)換數(shù)為3，沒(méi)有發(fā)生堿基顛換；COⅠ序列存在74個(gè)變異位點(diǎn)，G+C含量為0.326，堿基轉(zhuǎn)換數(shù)為21，堿基顛換數(shù)為5。與ND1基因相比，COⅠ基因序列的突變位點(diǎn)較多，堿基替換種類中不僅存在堿基轉(zhuǎn)換還存在堿基顛換。樣本的COⅠ序列核苷酸多樣性(Pi)為0.017 3，高于ND1(0.004 7)，綜合其他數(shù)據(jù)可見(jiàn)所研究地區(qū)日本血吸蟲(chóng)的COⅠ基因比ND1基因具有更高的序列多樣性。見(jiàn)表1。

表1 安徽省日本血吸蟲(chóng)線粒體ND1和COⅠ基因序列的基本特征

對(duì)不同地區(qū)血吸蟲(chóng)序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，來(lái)自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本ND1的基因變異位點(diǎn)數(shù)、核苷酸多樣性(Pi)、單倍型個(gè)數(shù)和單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)均高于來(lái)自山丘型流行區(qū)的樣本。來(lái)自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本COⅠ序列的變異位點(diǎn)數(shù)、核苷酸多樣性也明顯高于來(lái)自山丘型流行區(qū)的樣本。見(jiàn)表2。

表2 安徽省不同地區(qū)日本血吸蟲(chóng)線粒體ND1和COⅠ基因序列比較

2.2不同地區(qū)日本血吸蟲(chóng)種群間遺傳距離和進(jìn)化分析 不同地區(qū)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的ND1和COⅠ基因序列均存在略微差異。來(lái)自山丘型流行區(qū)與兩處來(lái)自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本之間，ND1序列遺傳距離分別為0.004 8和0.003 3；COⅠ序列遺傳距離均為0.035。兩處來(lái)自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本之間ND1和COⅠ序列遺傳距離為0.001 8和0.007。

依據(jù)COⅠ 和ND1序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，來(lái)自山丘型流行區(qū)和湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本ND1序列沒(méi)有較大的差異，見(jiàn)圖1A。而COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，來(lái)自山丘型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本單獨(dú)成簇，且Bootstrap值為100%，說(shuō)明和來(lái)自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本相比，來(lái)自山丘型流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本COⅠ基因序列發(fā)生了一定程度的變化，見(jiàn)圖1B。

注：A為基于ND1序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，B為基于COⅠ序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，枝上數(shù)字為bootstrap 百分比。ST為來(lái)自山丘型流行區(qū)的樣本，ZY和DG為來(lái)自兩處湖沼型流行區(qū)的樣本。

3 討 論

日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)類型主要分為湖沼型流行區(qū)、洲灘型和山丘型。本研究選擇了來(lái)自安徽省三個(gè)縣(區(qū))、兩種流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)樣本，對(duì)兩個(gè)線粒體基因片段進(jìn)行序列分析，從而初步探討不同地區(qū)日本血吸蟲(chóng)群體的線粒體基因差異。從不同地區(qū)的縱向比較來(lái)看，無(wú)論是ND1基因還是COⅠ基因，湖沼型流行區(qū)樣本的變異位點(diǎn)數(shù)、核苷酸多樣性(Pi)、核苷酸差異平均數(shù)明顯高于山丘型流行區(qū)。這可能是因?yàn)樯角鹦土餍袇^(qū)環(huán)境相對(duì)封閉和保守，其間的生物群體發(fā)生基因交流的機(jī)會(huì)較少，發(fā)生的頻率也更低，因此種群相對(duì)穩(wěn)定；而湖沼型、水網(wǎng)型地區(qū)，水域面積廣闊，加之不時(shí)爆發(fā)的夏季洪水，這些流行區(qū)的釘螺隨水流遷移更頻繁，導(dǎo)致日本血吸蟲(chóng)基因交流也更頻繁。

日本血吸蟲(chóng)在中國(guó)分布的種系研究顯示，不同地域的日本血吸蟲(chóng)在基因、表型、流行特征等方面不完全相同，學(xué)者認(rèn)為可將其分為不同的地域株[14-16]。邱持平[14]研究發(fā)現(xiàn)湖南、安徽、湖北、四川及江蘇的日本血吸蟲(chóng)株ND1基因和COⅠ基因存在兩種基因型。郭凱文[15]依據(jù)線粒體COⅠ 和ND1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示中國(guó)大陸日本血吸蟲(chóng)分為三類：中國(guó)山區(qū)型地域株、湖沼江灘型地域株、湖北地域株。安徽省日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)以湖沼型為主，兼有水網(wǎng)型和山丘型。池州市石臺(tái)縣是安徽省內(nèi)典型的山丘型血吸蟲(chóng)病流行區(qū)。石臺(tái)地區(qū)的日本血吸蟲(chóng)具有和其他地區(qū)日本血吸蟲(chóng)不同的生物學(xué)特性，其主要保蟲(chóng)宿主是野鼠[17-18]，且當(dāng)?shù)馗腥拘葬斅菥哂幸归g逸蚴的習(xí)性[19-20]。本研究首次依據(jù)線粒體COⅠ和ND1基因?qū)κ_(tái)地區(qū)日本血吸蟲(chóng)群體進(jìn)行遺傳進(jìn)化研究，結(jié)果表明石臺(tái)縣日本血吸蟲(chóng)群體的COⅠ基因與樅陽(yáng)縣、大觀區(qū)的樣本之間具有一定的差異，而ND1基因沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。依據(jù)本研究結(jié)果，盡管石臺(tái)山區(qū)的日本血吸蟲(chóng)出現(xiàn)了流行病學(xué)和生物學(xué)上的差異，但是基因水平差異還尚不明顯。這可能是因?yàn)槿鼐挥诎不帐?nèi)，且三者之間地理位置較近。

本研究結(jié)果初步表明安徽省石臺(tái)縣山丘型日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)的日本血吸蟲(chóng)在線粒體基因水平與湖沼型流行區(qū)(安慶市大觀區(qū)、銅陵市樅陽(yáng)縣)的日本血吸蟲(chóng)具有一定差異?；谑_(tái)縣日本血吸蟲(chóng)保蟲(chóng)宿主和夜間逸蚴習(xí)性的特殊性，其基因差異是否會(huì)影響其對(duì)小鼠或者家兔的感染性和致病性等還有待進(jìn)一步研究。