管曉燕，馬 銳，王 倩，廖成成，肖琳琳，趙玉潔，劉建國

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科,貴州 遵義 563099；2.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室暨遵義市口腔疾病研究重點實驗室,貴州 遵義 563006)

低強度激光能產(chǎn)生特殊的生物刺激作用，激活細胞，促進牙槽骨改建[1]。骨微穿孔術(shù)通過骨創(chuàng)傷，可引起周圍骨質(zhì)快速脫礦，骨改建加速[2]。低強度激光與骨微穿孔術(shù)是目前加速正畸治療領(lǐng)域的兩大研究熱點，在對于臨床正畸治療的輔助加速具有極大潛力。本實驗擬驗證低強度激光與骨微穿孔術(shù)促進正畸牙移動的有效性，探討二者協(xié)同作用在療效和組織學(xué)水平的影響，奠定其進一步臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 動物實驗在遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心開展。Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(6周齡，雄性，150～200 g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分組(n=15)。分組情況如下：激光照射合并加力組(LLL)、骨微穿孔術(shù)合并加力組(MOPs)、骨微穿孔術(shù)聯(lián)合激光照射合并加力組(聯(lián)合)以及對照組。對照組單獨給予加力；LLL組應(yīng)用加力合并激光照射(100 mW功率， 50 s照射時間，0.5 cm2光斑面積)；MOPs組應(yīng)用加力合并骨微穿孔術(shù)；聯(lián)合組采取加力、激光照射(參數(shù)同LLL組)、骨微穿孔術(shù)3種干預(yù)措施聯(lián)合使用。各干預(yù)組及對照組分別在實施1、3、5、7、14 d時進行組織切片取樣及測定牙移動距離。

1.2 材料 鎳鈦拉簧(0.010 in×6 mm，速航NIC，中國)；美佳印彈性體印膜材料(0型、3型，滬鴿，中國)；正畸測力計(天天齒科，中國)；正畸支抗套裝(1.2 mm×8 mm，HUBIT，韓國)；半導(dǎo)體激光治療儀(300IB型，三頓，中國)；立體顯微鏡(M205C，德國 Leica)，Leica Application Suite V 4測量軟件。

1.3 動物模型的建立 腹腔注射麻醉(水合氯醛，10%)實驗動物，麻醉后采取二次印模法以動物上頜牙齒為模板制備硅橡膠印模(見圖1A)并制作石膏模型。采用光固化樹脂在上頜切牙唇、舌、遠中面分層堆出上寬下窄倒梯形，隨后沿唇側(cè)、遠中唇軸角接近齦緣處磨出上頜切牙固位溝(深度約0.5 mm)。操作者直視下采用正畸結(jié)扎絲(直徑0.20 mm)穿過上頜第一和第二磨牙間隙。結(jié)扎絲連接鎳鈦拉簧，拉簧另一端穿入結(jié)扎絲(0.25 mm)，越過切牙樹脂結(jié)扎于固位溝內(nèi)，采用正畸測力計控制拉簧力量(50 g)，見圖1B。

采用激光探頭直接接觸照射大鼠上頜第一磨牙(見圖1C)，于造模第0～6天連續(xù)照射，每日1次。在距離雙側(cè)上頜第一磨牙近中5 mm處，采用正畸微種植釘在皮質(zhì)骨上鉆取3個骨微穿孔(深度1.0 mm，間距1.0 mm)，見圖1D。

A：安裝正畸加力裝置前先取上頜印模；B：建立上頜雙側(cè)第一磨牙加力裝置；C：骨微穿孔部位；D：激光照射部位。圖1 大鼠正畸模型建立過程

1.4 監(jiān)測正畸牙移動的距離 建模結(jié)束后處死大鼠，制備上牙列印模，注入超硬石膏備用。于體視顯微鏡下，水平放置石膏模型并保持牙齒咬合面與觀測臺平行，采用本文方法所述測量軟件(精度0.000 1 mm)測量上頜第一與第二磨牙咬合面中央牙尖遠中邊緣嵴之間的距離，連續(xù)測量3次取平均值(見圖2)。計算建模前后測量數(shù)據(jù)差值作為牙移動距離。上述方法參照文獻報道[3]方法實施。

A：建模前測量；B：建模后測量；×20。圖2 正畸牙齒移動距離的測量

1.5 組織切片制備 剔除雙側(cè)上頜骨軟組織后，置于4%多聚甲醛固定液中48 h，固定完成后于10% EDTA脫鈣溶液(隔日更新溶液)中室溫脫鈣4周，針尖可無阻力刺穿組織作為脫鈣完成標(biāo)準(zhǔn)。脫鈣標(biāo)本由專業(yè)病理人員進行石蠟包埋并行2 μm切片。切片置于溫水(56 ℃)中展平并貼片于載玻片，分別采用蘇木精-伊紅染色法 (Hematoxylin-eosin staining，HE )和抗酒石酸性磷法(Tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP)染色。

2 結(jié)果

2.1 各類干預(yù)方法 對牙移動距離的影響在加載正畸力后的第1、3、5、7、14天制取正畸術(shù)后模型，測量各組實驗動物術(shù)前、術(shù)后石膏模型，發(fā)現(xiàn)各組大鼠牙移動距離變化的總趨勢是隨加力時間延長而加大。以牙移動距離為監(jiān)測指標(biāo)，施加正畸力3 d內(nèi)，各組動物牙移動量差距無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。至第5天，聯(lián)合組動物牙移動距離相對于對照組顯著加大(P<0.05)。至第7天，聯(lián)合組與對照組間的差異進一步增大(P<0.01)。至第14天，各干預(yù)組牙移動量均較對照組明顯增加，統(tǒng)計顯著性水平分別為：LLL組(P<0.05)、MOPs組(P<0.01)，聯(lián)合組(P<0.001)。其中，聯(lián)合組牙移動距離顯著高于LLL組(P<0.05)。聯(lián)合組與MOPs組間牙移動距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3)。

*、**、***：分別與對照組相比，P<0.05、P<0.01和P<0.001。圖3 不同干預(yù)方法下牙移動距離對比

2.2 HE染色觀測組織學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，至第1天，各干預(yù)措施對牙周組織均無明顯改變，在壓力測和張力側(cè)觀測到的其他主要改變包括：在壓力側(cè)，牙周組織血管受壓導(dǎo)致血流量減少，牙周膜間隙受擠壓變窄；張力側(cè)牙周間隙增寬、膠原纖維沿正畸力牽引方向拉伸變長。1～3 d內(nèi)，各組動物牙周組織變化趨勢相似，但在不同干預(yù)措施間變化程度不同。至第3天，聯(lián)合組壓力側(cè)牙槽骨表面出現(xiàn)骨吸收現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為蠶蝕狀吸收陷窩。至第5天，骨吸收現(xiàn)象在各組中均有表現(xiàn)。至第7天，各干預(yù)組牙槽骨表現(xiàn)出不同程度吸收現(xiàn)象，壓力側(cè)牙周膜間隙寬度有恢復(fù)跡象，可能是由于骨組織被吸收后被纖維結(jié)締組織所取代所致；張力側(cè)成纖維細胞增殖活躍，少量成骨細胞在牙槽骨表面散在排列。至第14天，對照組破骨細胞減少水平較為明顯，骨吸收變得緩慢；破骨細胞在各干預(yù)組壓力側(cè)牙周組織中的數(shù)量仍然較多，骨吸收活動保持活躍；薄層類骨質(zhì)在各干預(yù)組張力側(cè)牙槽骨表面出現(xiàn)，且觀察到立方形的成骨細胞緊貼于類骨質(zhì)邊緣的牙周膜中(見圖4、5)。

2.3 TRAP染色觀測組織學(xué)變化 染色結(jié)果顯示，在壓力側(cè)牙槽骨表面骨吸收陷窩中，單核或多核破骨細胞胞漿和細胞核分別呈酒紅色和藍色。在觀察周期內(nèi)(0～14 d)，破骨細胞數(shù)量在各組均出現(xiàn)先增長后減少的趨勢。至第5天，對照組中破骨細胞數(shù)量出現(xiàn)最高值，但迅速出現(xiàn)降低，至第14天，對照組中破骨細胞數(shù)量降低至初期水平；各干預(yù)組破骨細胞數(shù)量也在第5天達到最峰值，達峰并保持至第7天后出現(xiàn)降低趨勢，但至第14天時依然有較多破骨細胞被觀察到(見表1、圖6)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；TR：牙根；HE染色(×400)。圖4 壓力側(cè)牙周組織

TR：牙根；PDL：牙周膜；AB：牙槽骨；HE染色(×400)。圖5 張力側(cè)牙周組織

對各組破骨細胞數(shù)量進行統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)(見表1)，觀察至第3天，破骨細胞數(shù)量的變化仍然沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。至第5天和第14天時，聯(lián)合組破骨細胞技術(shù)相對于對照組出現(xiàn)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。在第7天以及14 d時，破骨細胞數(shù)量在LLL組及MOPs組內(nèi)均表現(xiàn)出較對照組顯著增多的現(xiàn)象(P<0.05)。

表1 各干預(yù)組大鼠在不同時間內(nèi)破骨細胞計數(shù)結(jié)果個/視野)

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；TR：牙根；TRAP染色(×400)。圖6 壓力側(cè)破骨細胞

3 討論

正畸治療是一個需要耗時1～2年的漫長治療過程[4-5]。在這一治療過程中，有可能出現(xiàn)齲齒[6]、牙齦萎縮[7]和牙根吸收[8]等不良反應(yīng)。正畸治療中需要長期佩戴矯治器，這也會給患者正常的社交生活帶來一定的困擾。因此，加速牙齒移動從而快速結(jié)束治療成為正畸治療的主要挑戰(zhàn)。目前取得的進展主要分為藥物治療、物理治療、外科治療等。藥物治療除一些臨床常用藥物[9](卡馬西平、丙戊酸鈉)外，還包括激素[10-11]、中草藥[12]、生長因子[13-14]等。物理治療包括電磁場、微電流、機械振動、低強度激光等[15]；外科治療主要包括超聲骨刀切開術(shù)、骨皮質(zhì)切開術(shù)等，還有近幾年發(fā)展的效率高且創(chuàng)傷小的骨微穿孔術(shù)[16-18]。

LLL(Low-level laser)是低強度激光技術(shù)的簡稱。具有安全、無創(chuàng)傷等特點，具有較強的患者依從性。LLL在將光能作用于生物體的同時，不會造成損傷，卻足夠激活細胞，引起機體產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)應(yīng)答，最終促進毛發(fā)的生長及加速傷口愈合、潰瘍愈合。在骨折快速愈合方面，LLL還從刺激骨痂內(nèi)血管新生，促進成纖維細胞、軟骨細胞增殖等方面產(chǎn)生作用[1]。LLL于2000年開始應(yīng)用于大鼠正畸治療研究[19]，在促進牙槽骨的改建和加速正畸牙齒的移動兩方面都顯示出優(yōu)勢。隨后的臨床研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以使尖牙移動速度提高34%[20]。傳統(tǒng)方法不能避免創(chuàng)傷以及侵襲性問題，會給患者的健康骨組織和牙周結(jié)構(gòu)造成一定傷害，從而導(dǎo)致患者接受度較低。隨著加速正畸牙移動速度的輔助方法不斷改進，微創(chuàng)趨勢越來越明顯[21-22]。2013年，經(jīng)過改良的外科手術(shù)微創(chuàng)術(shù)式骨微穿孔術(shù)(Micro-osteoperforations，MOPs)被Alikhani等[2]提出。該術(shù)式避免了對軟組織進行翻瓣或造成附加傷口，而采用選擇性以點存在的形式穿透骨皮質(zhì)，產(chǎn)生的骨穿孔小而淺，從而最低限度減輕骨創(chuàng)傷并減少進一步的炎癥反應(yīng)[23]。骨創(chuàng)傷發(fā)生后，刺激炎癥因子和趨化因子釋放，周圍骨質(zhì)快速脫礦,骨密度減小，骨改建加快，這一現(xiàn)象被稱為局部加速現(xiàn)象[24](Regional acceleratory phenomenon,RAP)，被認為是MOPs加速正畸牙移動的基礎(chǔ)理論。

本實驗大鼠正畸模型上，研究了聯(lián)合應(yīng)用低強度激光與骨微穿孔技術(shù)對正畸牙齒移動的影響及組織學(xué)改變。

Altan[25]和Seifi[26]的研究結(jié)果表明在考慮激光照射劑量對于正畸牙移動的影響時，除考慮激光總能量值外，還應(yīng)該考慮照射光斑面積大小。因此，本研究預(yù)實驗采用LLL激光能量密度參數(shù)確定照射劑量：固定了LLL激光功率為100 mW、光斑面積0.5 cm2，通過調(diào)整照射時長來控制照射劑量，設(shè)定5個組，照射時長分別為10、25、50、75、100 s，對應(yīng)能量密度分別是2、5、10、15、20 J/cm2。結(jié)果表明，10 J/cm2的LLL照射引起的正畸牙移動值最大。因此選定該激光照射劑量用于本實驗的LLL組和聯(lián)合組。

在前3 d觀察期內(nèi)，牙移動距離參數(shù)上無明顯變化；在第5天和第7天時，聯(lián)合組大鼠牙齒移動與對照組相比改變明顯(P<0.05)；至第14天，兩組差距進一步加大(P<0.001)。在單一干預(yù)因素上，低強度激光組與骨微穿孔組也發(fā)生牙移動距離相對于對照組的顯著增加(P<0.05、P<0.01)。本研究證實了單獨應(yīng)用低強度激光或者骨微穿孔均可加快正畸牙齒移動，且二者有協(xié)同作用，更快地加速正畸牙移動。

在組織學(xué)研究上，矯治力的加載在加力初期會導(dǎo)致牙周組織改變，牙周膜間隙受力壓縮導(dǎo)致牙齒移動，此時應(yīng)用的低強度激光和骨微穿孔等刺激方法還沒有足夠時間產(chǎn)生效果，這與Yamaguchi[27]和Sugimori[28]等學(xué)者的報道吻合。至第3天后，聯(lián)合組和各干預(yù)組牙周組織開始出現(xiàn)變化，壓力側(cè)牙槽骨表面開始出現(xiàn)蠶蝕狀吸收陷窩，TRAP染色顯示陷窩內(nèi)多核破骨細胞緊貼骨組織邊緣。至第5天，各組破骨細胞數(shù)目均達高峰，其中聯(lián)合組開始出現(xiàn)與對照組的顯著差異(P<0.05)，證明了聯(lián)合運用低強度激光和骨微穿孔可在早期協(xié)同刺激破骨細胞增殖。至第7天，及第14天，各干預(yù)組依然維持著一定數(shù)量的破骨細胞，骨吸收活動繼續(xù)活躍的，對照組骨吸收活動及破骨細胞數(shù)量在第14天時都降至實驗初期的水平。牙槽骨改建是正畸牙移動的分子基礎(chǔ)，破骨細胞在吸收骨基質(zhì)的有機物和礦質(zhì)中產(chǎn)生骨吸收凹陷，骨吸收速度決定了牙移動的速度[29]；推測低強度激光和骨微穿孔可能通過刺激破骨細胞形成維持較高水平破骨細胞數(shù)量，組中加快骨改建和加速正畸牙齒移動。還有研究表明，當(dāng)骨皮質(zhì)穿刺術(shù)與低強度激光聯(lián)用時，由于LLL的協(xié)同效應(yīng)，甚至減少了骨皮質(zhì)穿刺的點數(shù)，也能達到相同的骨反應(yīng)[30]。

綜上,低強度激光和骨微穿孔均可有效加速大鼠正畸牙移動，且具備協(xié)同作用，提升破骨細胞的形成速度和數(shù)量，顯著增大牙移動距離。因此，將無創(chuàng)的低強度激光與微創(chuàng)的骨微穿孔聯(lián)合使用,有望成為臨床正畸治療術(shù)的潛在新方法。