夏穎 丁娟 張建青 陳宏

由于創(chuàng)傷、燒傷和慢性疾病等引起的皮膚缺損，每年有近千萬的患者需要移植皮膚替代物進(jìn)行創(chuàng)口的修復(fù)[1]。毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞（hair follicle mesenchymal stem cells，HF-MSCs）來源廣泛，獲取方便，有較強(qiáng)的多向分化潛能和體外擴(kuò)增能力，是較理想的干細(xì)胞來源[2]。如何高效擴(kuò)增具有自我更新能力和多向分化潛能的MSCs，成為干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[3]。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）是一種多功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，用過表達(dá)IGF-1 的成纖維細(xì)胞干預(yù)動(dòng)物皮膚創(chuàng)口，可加快創(chuàng)口愈合速度[4]。IGF-1 也能通過活化PI3K/Akt 通路來促進(jìn)骨髓來源的MSCs 增殖并抑制其凋亡[5]。但I(xiàn)GF-1 處理對(duì)HF-MSCs 的作用并不明確。本次研究旨在探討IGF-1 對(duì)離體培養(yǎng)的HF-MSCs 增殖能力的影響，并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 HF-MSCs 分離與培養(yǎng) 2019 年1 月至2020 年12 月期間，選擇1 周齡左右的健康雄性SD 大鼠，大鼠由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，經(jīng)腹腔注射10%戊巴比妥鈉處死，使用75%乙醇浸泡消毒。在體視顯微鏡下，用眼科剪分離出觸須并剪下觸須部皮膚，采用0.9%氯化鈉注射液漂洗干凈；將毛囊組織置于1% Ⅳ型膠原酶和5 g/L中性蛋白酶混合液中，37 ℃消化30 min。取出消化后的毛囊組織在顯微鏡下分離出毛囊隆突，將毛囊隆突置于上述消化液中消化30 min；隨后加入含有10%胎牛血清的KSFM 培養(yǎng)基（由美國(guó)Gibco 公司生產(chǎn)）終止消化。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，2～3 d 換液1 次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合后，消化傳代。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HF-MSCs 表面抗原 取第4 代HF-MSCs，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)入15 ml 離心管中，1000 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 ml 磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/ml 并移入1.5 ml EP 管中。用4%甲醇固定細(xì)胞5 min 后，加入5%的牛蛋白血清封閉30 min，再次離心后用磷酸鹽緩沖液重懸，加入CD31、CD44、CD73、CD90 和CD105 抗體（由美國(guó)Abcam 公司生產(chǎn)），冰上孵育30 min，加入熒光色標(biāo)記山羊抗兔和抗鼠二抗（由中國(guó)江蘇碧云天研究所生產(chǎn)）后繼續(xù)避光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液清洗1 次，離心結(jié)束棄上清液，加入500 μl 的磷酸鹽緩沖液重懸后上機(jī)行流式細(xì)胞分析。

1.3 HF-MSCs 成骨和成脂肪誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 收集P4 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×104/孔密度接種于24孔板，細(xì)胞貼壁24 h 后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含0.2 mmol/L抗壞血酸、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）進(jìn)行誘導(dǎo)，此后每隔2 d 更換培養(yǎng)基1 次。誘導(dǎo)3 周后觀察到細(xì)胞聚集并有礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)時(shí)，棄掉誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min 后按照試劑盒說明書行堿性磷酸酶染色，顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況。此外，使用脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10 μg/ml 胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1 二甲基黃嘌呤、100 mmol/L 吲哚美辛）進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)基1 次。同樣誘導(dǎo)3 周后固定，使用油紅-O 染液染色30 min，60%異丙醇洗去多余油紅-O，顯微鏡下觀察紅色脂滴情況。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的血管平滑肌細(xì)胞，以5×103/孔細(xì)胞接種于96 孔板，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，本次研究IGF-1 濃度參考Zhang 等[6]研究，分為10 nM IGF-1 組（10 nmol/L IGF-1）、25 nM IGF-1 組（25 nmol/L IGF-1）、50 nM IGF-1 組（50 nmol/L IGF-1）和對(duì)照組，各組加入不同的干預(yù)因素干預(yù)24 h、48 h、72 h 和96 h。待檢測(cè)時(shí)每孔加入5 mg/ml MTT 工作液20 μl，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后每孔加入150 μl 二甲基亞砜并將其置于搖床上10 min，用SpectraMax Plus 酶標(biāo)儀（由美國(guó)Molecular devices 公司生產(chǎn)）于570 nm處測(cè)定每個(gè)孔OD 值，以表示細(xì)胞增殖能力，重復(fù)3 次，取均值。檢測(cè)MAPK 通路的作用時(shí)，分為IGF-1+10 μM SB203580 組、IGF -1+10 μM U0126 組和IGF-1+10 μM SP600125 組，干預(yù)48 h、72 h和96 h后檢測(cè)細(xì)胞OD值。

1.5 IGF-1 處理對(duì)HF-MSCs 內(nèi)IGF-1R 表達(dá)的影響 干預(yù)后提取10 nM IGF-1 組、25 nM IGF-1 組、50 nM IGF-1 組和對(duì)照組的細(xì)胞蛋白，使用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，各組取30 μg 等量蛋白進(jìn)行SDSPAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)法90 min 將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm孔徑的PVDF 上。轉(zhuǎn)膜后TBST 洗膜3 次，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入IGF-1R 和p-IGF-1R 抗體（由美國(guó)Cell signaling technology 公司生產(chǎn)）4 ℃孵育過夜。隨后，常溫下TBST 洗膜3 次，加入對(duì)應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀上拍照。以目的蛋白與相應(yīng)非磷酸化蛋白的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot 檢測(cè)MAPK 通路蛋白改變 干預(yù)后提取10 nM IGF-1 組、25 nM IGF-1 組、50 nM IGF-1 組和對(duì)照組細(xì)胞蛋白，使用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，各組取30 μg 等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)法90 min 將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm 孔徑的PVDF上。轉(zhuǎn)膜后TBST 洗膜3 次，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入IGF-1R、p-IGF-1R 抗體、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK 和β-actin 抗體（由美國(guó)Cell signaling technology 公司生產(chǎn)）4 ℃孵育過夜。隨后，常溫下TBST洗膜3 次，加入對(duì)應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h。ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀上拍照。以目的蛋白與相應(yīng)非磷酸化蛋白的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各組之間比較采用單因素方差分析和SNK 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HF-MSCs 的鑒定和分化潛能檢測(cè)見封二圖1、2

由封二圖1 可見，CD44、CD73、CD90、CD105 間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)陽性率分別為99.72%、99.80%、99.41%和96.44%，而CD31呈陰性，表達(dá)率僅為0.05%。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HF-MSCs表面標(biāo)志物

由封二圖2 a 可見，加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 周后，細(xì)胞行油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂滴形成處細(xì)胞被染成紅色，證實(shí)提取HF-MSCs 具有成脂肪分化潛能。

由封二圖2 b 可見，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)3 周后，HF-MSCs 行堿性磷酸酶染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣鹽沉積結(jié)節(jié)處被染成藍(lán)紫色，證實(shí)HF-MSCs 有成骨分化潛能。

圖2 HF-MSCs成脂肪和成骨分化能力檢測(cè)

2.2 不同濃度不同時(shí)間的IGF-1 對(duì)HF-MSCs 增殖影響見表1

表1 不同濃度不同時(shí)間的IGF-1對(duì)HF-MSCs增殖影響

由表1 可見，干預(yù)24 h 時(shí)，25 nM IGF-1 組和50 nM IGF-1 組細(xì)胞OD 值較對(duì)照組增加（t分別=5.96、8.46，P均＜0.05）；干預(yù)48 h、72 h 和96 h 時(shí)，10 nM IGF-1 組、25 nM IGF-1 組和50 nM IGF-1 組細(xì)胞OD 值較對(duì)照組增加（t分別=5.69、9.23、11.10、7.88、11.50、14.00、11.10、13.60、16.90，P均＜0.05），且呈劑量依賴性（F分別=5.43、6.03、7.94，P均＜0.05）。

2.3 IGF-1處理對(duì)HF-MSCs 內(nèi)IGF-1R表達(dá)的影響見圖1

由圖1 a 可見，IGF-1 干預(yù)HF-MSCs 48 h 后，與對(duì)照組比較，10 nM IGF-1 組、25 nM IGF-1 組和50 nM IGF-1 組細(xì)胞內(nèi)IGF-1R 磷酸化水平逐漸增加，且呈濃度依賴性。由圖1b可見，50 nmol/L IGF-1干預(yù)HF-MSCs 后，5 min時(shí)細(xì)胞內(nèi)IGF-1R磷酸化水平開始增加，15 min繼續(xù)增加，30 min開始下降。

圖1 IGF-1處理對(duì)HF-MSCs內(nèi)IGF-1R表達(dá)的影響

2.4 IGF-1 對(duì)HF-MSCs 細(xì)胞內(nèi)MAPK 通路的影響見圖2

圖2 不同濃度的IGF-1對(duì)HF-MSCs細(xì)胞內(nèi)MAPK通路的影響

由圖2 可見，與對(duì)照組比較，10 nM IGF-1 組的p-p38 磷酸化水平增加；25 nM IGF-1 組和50 nM IGF-1 組的p38 和ERK1/2 磷酸化水平明顯提高，而JNK磷酸化水平無改變。

2.5 MAPK 信號(hào)通路在IGF-1 促進(jìn)HF-MSCs 增殖中的作用見表2

表2 不同干預(yù)因素對(duì)HF-MSCs細(xì)胞增殖的影響

由表1 可見，干預(yù)48 h 時(shí)，IGF-1 組的OD 值高于對(duì)照組，IGF-1+SB203580 組和IGF-1+U0126 組的OD 值低于IGF-1 組（t分別=7.05、5.28、6.17，P均＜0.05）。干預(yù)72 h 時(shí)，IGF-1 組的OD 值高于對(duì)照組，IGF-1+SB203580 組和IGF-1+U0126 組的OD值低于IGF-1 組（t分別=10.55、7.91、9.04，P均＜0.05）。干預(yù)96 h時(shí)，IGF-1 組的OD值高于對(duì)照組，IGF-1+SB203580 組和IGF-1+U0126 組的OD 值低于IGF-1 組（t分別=9.83、6.85、7.22，P均＜0.05）。干預(yù)48 h、72 h 和96 h 時(shí)，與IGF-1 組比較，IGF-1+SP600125 組細(xì)胞OD 值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.93、1.34、1.05，P均＞0.05）。

3 討論

HF-MSCs 作為毛囊的獨(dú)特干細(xì)胞，在毛發(fā)的再生中具有重要作用，可作為種子細(xì)胞成為組織工程學(xué)皮膚構(gòu)建的研究熱點(diǎn)[7]。本次研究分離的大鼠HF-MSCs 表達(dá)CD44、CD73、CD29、CD90、CD166 和CD105 等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，而不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31。同時(shí)，通過油紅-O和堿性磷酸酶染色證明其具有向脂肪和骨組織多分化的潛能。為進(jìn)一步探索影響HF-MSCs增殖的因素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)多種細(xì)胞（包括干細(xì)胞）的增殖，因此了解生長(zhǎng)因子能否促進(jìn)HF-MSCs 增殖意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子[8]和血小板源生長(zhǎng)因子[9]等均可以有效地促進(jìn)HF-MSCs增殖和毛囊再生。IGF-1 也是生長(zhǎng)因子的一種，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝等多種生物活性的多肽分子[10]。IGF-1 可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，加速其向牙周膜成纖維細(xì)胞分化[11]。但是其對(duì)HF-MSCs是否有促增殖作用并不清楚。

本次研究結(jié)果顯示，干預(yù)24 h 時(shí)，25 nM IGF-1組和50 nM IGF-1 組細(xì)胞OD 值較對(duì)照組增加（P均＜0.05）；干預(yù)48 h、72 h和96 h時(shí)，10 nM IGF-1 組、25 nM IGF-1 組和50 nM IGF-1 組細(xì)胞OD 值較對(duì)照組增加，且呈劑量依賴性（P均＜0.05），表明不同濃度IGF-1 有促進(jìn)HF-MSCs 增殖的作用，且具有劑量依賴性。IGF-1 可以促進(jìn)HF-MSCs 增殖，但I(xiàn)GF-1 的作用機(jī)制在不同的細(xì)胞中有種屬和細(xì)胞特異性。要了解IGF-1 是否通過IGF-1R 途徑發(fā)揮作用，首先要知道HF-MSCs是否表達(dá)IGF-1R。本次研究中Western blot結(jié)果顯示，HF-MSCs表達(dá)IGF-1R，且IGF-1 干預(yù)HF-MSCs 后可通過磷酸化激活I(lǐng)GF-1R，提示IGF-1 可作用于HF-MSCs 內(nèi)IGF-1R繼而進(jìn)行下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究表明IGF-1 過表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，繼而減少心肌梗死面積[12]。在造血干細(xì)胞中，IGF-1 可以明顯激活蛋白激酶A 促進(jìn)造血干細(xì)胞再生[13]。與其類似，本次研究發(fā)現(xiàn)IGF-1 處理的HF-MSCs 內(nèi)MAPK 通路中的p38 通路和ERK1/2 通路被激活，而對(duì)JNK 通路無明顯影響。提示MAPK 通路可能在IGF-1 促毛囊干細(xì)胞增殖中起作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，使用SB203580 和U0126 干預(yù)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，干預(yù)48 h、72 h 和96 h 時(shí)，與IGF-1 組比較，IGF-1+SB203580 和IGF-1+U0126 組的細(xì)胞OD 值下降（P均＜0.05），而IGF-1+SP600125 組細(xì)胞OD 值無變化（P均＞0.05），表明SB203580 和U0126 能夠部分逆轉(zhuǎn)IGF-1 對(duì)HF-MSCs 的促進(jìn)作用。初步結(jié)果證實(shí)，IGF-1 可以磷酸化激活I(lǐng)GF-1R、MAPK（p38 和ERK）通路來促進(jìn)HF-MSCs 增殖。然而，IGF-1R 下游存在許多增殖相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 等[14]，有待后續(xù)進(jìn)一步探討IGF-1 促進(jìn)HF-MSCs 的其他可能機(jī)制。此外，本次研究并未探討IGF-1 促進(jìn)HF-MSCs 增殖的同時(shí)對(duì)其分化能力的影響，后續(xù)將進(jìn)一步行細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分析IGF-1對(duì)HF-MSCs分化能力的影響。

綜上所述，IGF-1 可通過激活p38 和ERK1/2 通路促進(jìn)HF-MSCs 增殖，具有調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞活性的作用。后續(xù)將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討IGF-1 對(duì)大鼠皮膚損傷后毛囊再生的促進(jìn)作用及其可能機(jī)制，為基于開發(fā)IGF-1 干預(yù)毛囊再生相關(guān)疾病提供新的研究思路。