黃愛軍，顧佩佩，胡 燕，丁 敏，王 瑩

(1 贛南師范大學生命科學學院，江西贛州，341000；2 國家臍橙工程技術研究中心，江西贛州，341000；3 江西省贛州市果業(yè)局，江西贛州，341000)

柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing, HLB)是當今柑桔生產中最具毀滅性的病害，可以為害柑桔類所有栽培品種[1]。在我國，HLB主要由韌皮部桿菌亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus, CLas)引起。柑桔植株一旦感病，果實品質和產量均會受到嚴重影響，幼樹一般在發(fā)病后2～3年內死亡，成年樹一般在5～8年內死亡或喪失經濟價值。目前，只能通過砍除田間病樹、種植無病毒苗木和防控田間媒介昆蟲的方式控制黃龍病的蔓延。

柑桔木虱是HLB田間最主要傳播介體昆蟲。一個園區(qū)一旦監(jiān)測到帶病柑桔木虱，一般在半年到3年時間內，會檢測到帶病植株，隨后逐漸擴散到全園[2]。柑桔木虱以持久型方式傳播CLas，黃龍病菌可在柑桔木虱體內增殖，一旦帶毒終身傳毒[3]。因此，在HLB防控過程中，有必需對單頭柑桔木虱中的黃龍病菌進行監(jiān)測。目前，有多種方法可檢測單頭柑桔木虱中的黃龍病菌，但所需時間較長，且需要核酸擴增儀器等設備[4-6]，難以普及推廣到基層病害防控部門。核酸環(huán)介導等溫擴增技術(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一種快捷、靈敏的恒溫擴增技術，降低了對于儀器的要求，適宜基層部門使用。目前已建立了針對病原菌外膜蛋白基因、16S rDNA基因、假定蛋白基因的柑桔黃龍病LAMP檢測方法，檢測極限可達1 pg/μL[7-10]。DNA模板的提取也是檢測環(huán)節(jié)中耗時較多的一個環(huán)節(jié)。有研究結果顯示，采用Direct-PCR制樣法即通過組織裂解提取樣品粗核酸用于后續(xù)檢測，大大縮短了檢測過程[11]。筆者開展了將快速裂解制樣方法和LAMP技術相結合進行單頭柑桔木虱黃龍病菌檢測的研究，旨在提高單頭柑桔木虱黃龍病菌檢測效率和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 柑桔木虱樣品

攜帶及不帶CLas的柑桔木虱，均飼養(yǎng)于國家臍橙工程技術研究中心負壓實驗室。田間柑桔木虱采集于江西省贛州市瑞金縣武陽鎮(zhèn)、會昌縣麻州鎮(zhèn)和于都縣羅坳鎮(zhèn)的疑似感病果園。

1.2 主要試劑

動物組織直接PCR試劑盒(TP-01111)

表1 試驗所用引物及其序列

購于成都福際生物技術有限公司。Bst2.0 DNA聚合酶購自NEB公司。甜菜堿購自sigma公司。10 mmol/L濃度的dNTP溶液購自TaKaRa公司。SYBR Green Ⅰ(10 000×) 購自Solarbio公司。2× Taq Plus Master Mix購自近岸蛋白質科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司。試驗所用引物序列信息見表1，均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 單頭柑桔木虱裂解制樣 參照動物組織直接PCR試劑盒說明書，略有改動。將單頭柑桔木虱樣品放入0.2 mL離心管中，加入試劑盒中Buffer AL 50 μL、Foregene Protease 2 μL，磨碎樣品組織，研磨液在65 ℃恒溫裂解10 min，裂解完成后，取上清液做擴增模板。

1.3.2 LAMP擴增方法比較 對3種已建立的柑桔黃龍病菌LAMP檢測方法的擴增時間和檢測靈敏度進行比較，黃麗等[8]的方法簡稱為方法1，Rigano等[10]的方法簡稱為方法2，彭軍等[9]的方法簡稱為方法3，反應體系參照相應文獻。擴增時間比較時，以相同的帶菌柑桔木虱樣品核酸裂解液為模板，分別在10、20、30、40、50、60 min擴增時間下擴增。檢測靈敏度比較時，采用CTAB法[15]抽提柑桔木虱總核酸，通過Nanodrop 2000測定所得核酸濃度，以濃度為203.6 ng/μL的帶菌柑桔木虱核酸模板進行10倍梯度稀釋，65 ℃擴增60 min。反應結束后，分別進行熒光顯色和電泳觀察。熒光顯色觀察為擴增完成后加入1 μL 10 000× SYBR greenⅠ染料震蕩混勻可直接觀察(加染料略微震蕩混勻即可觀察，陽性和陰性樣品顏色差異可通過肉眼明顯分辨，個別難以辨別樣品可置于300 nm紫外光下觀察是否發(fā)出熒光)。

1.3.3 普通PCR、實時定量PCR檢測 普通PCR反應體系：2× Taq Plus Master Mix 10 μL，10 μmol/L正向引物/反向引物各0.5 μL，裂解所得粗提核酸模板(裂解制樣所得上清液) 1.0 μL，滅菌ddH2O 8 μL。擴增反應程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性20 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)。PCR反應結束后，取5 μL產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行條帶檢測。

實時定量PCR反應體系：FastStart Universal SYBR Green Master 10 μL，10 μmol/L正向引物/反向引物各0.5 μL，裂解所得粗提核酸模板(裂解制樣所得上清液)1.0 μL，滅菌ddH2O 8 μL。擴增反應程序為：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火40 s，40個循環(huán)。退火延伸階段自動采集熒光。熔解曲線程序為：94 ℃，60 s，55 ℃，60 s；然后從55 ℃開始每升高0.5 ℃保持10 s，連續(xù)升高80次。

1.3.4 田間樣品檢測 田間柑桔木虱樣品采集于瑞金武陽鎮(zhèn)、會昌麻州鎮(zhèn)、于都羅坳鎮(zhèn)3個果園，均確認有黃龍病病株，每個果園采集100頭，共300頭柑桔木虱。柑桔木虱樣品進行組織裂解提取核酸后，分別采用普通PCR、LAMP及實時定量PCR方法檢測攜帶黃龍病菌的情況，比較不同檢測方法檢出的帶菌率。

2 結果與分析

2.1 3種LAMP檢測方法擴增時間及靈敏度的比較

不同擴增時間比較結果顯示，方法2在擴增時間為20 min時即可觀察到微弱的擴增條帶，當擴增時間延長至30 min時擴增條帶明亮清晰，當繼續(xù)延長至40 min時目測擴增條帶亮度無明顯改變；方法1在擴增時間為50 min時可觀察到微弱的擴增條帶，當延長至60 min時才能觀察到明亮清晰的擴增條帶；方法3直到將擴增時間延長至90 min時才可觀察到明亮清晰的擴增條帶(見圖1)。靈敏度比較試驗中，方法1、2的檢測靈敏度分別在模板(203.6 ng/μL)稀釋至10-1和10-3，方法3在相同擴增時間(60 min)內未能檢測出病原(見圖1)。熒光顯色結果與電泳結果相同，多次重復試驗結果相同。因此，選擇方法2和擴增時間30 min開展后續(xù)檢測試驗。

圖1 3種LAMP擴增方法的擴增時間和靈敏度比較

2.2 LAMP與其他檢測方法的比較

應用革蘭氏陰性細菌通用引物27F/1492R對單頭柑桔木虱裂解制樣所得模板(上清液)進行PCR擴增，可獲得一條1 500 bp左右的擴增條帶，條帶清晰明亮。由此可見，通過簡單裂解制樣所得上清液，可用于后續(xù)檢測試驗。應用黃龍病菌特異性引物OI1/OI2c進行PCR擴增，檢測柑桔木虱樣品是否攜帶有黃龍病菌，發(fā)現在22份樣品中11份樣品有特異性擴增條帶，另外有個別樣品擴增條帶不清晰、難以辨認。然而，使用LAMP擴增方法(方法2，擴增30 min)，在22份樣品中，16份樣品有清晰且明亮條帶擴增。染料法所得結果與電泳結果一致(見圖2)。為防止LAMP擴增結果假陽性的出現，通過實時定量PCR的方法再次對以上22份樣品進行檢測，檢出陽性樣品16個，與LAMP檢出結果一一對應。這說明，所用LAMP檢測方法與實時定量PCR具有相同的靈敏度，能夠更大程度地檢出帶菌柑桔木虱樣品，而普通PCR方法則可能會出現假陰性結果。

圖2 不同檢測方法靈敏度比較

2.3 田間樣品檢測

300頭取自不同地點的柑桔木虱田間樣品采用裂解法制樣后，分別采用普通PCR、LAMP(方法2，擴增30 min)和qPCR方法檢測帶菌率。普通PCR檢測出的帶菌率在3%～17%；LAMP和qPCR兩種方法檢出結果能夠一一對應，檢出的帶菌率一致且高于普通PCR法(見表2)?？梢姡槍μ镩g柑桔木虱樣品(裂解法制樣)，采用LAMP和qPCR擴增方法可有效提高帶菌柑桔木虱的檢出率，而采用普通PCR的檢測方法可能會出現假陰性結果(即出現漏檢)。

表2 田間柑桔木虱樣品采用不同方法檢測柑桔黃龍病菌的帶菌率 %

3 討論與結論

柑桔木虱是柑桔黃龍病田間傳播的主要媒介昆蟲，監(jiān)測田間柑桔木虱的帶毒率對于病害防控具有重要意義，因此需要建立一種快速、簡捷、準確的檢測方法。本研究采用的快速裂解制樣法，所需樣品量少，操作簡單，無需液氮研磨，獲得的上清液(粗提核酸)可作為檢測模板，用于后續(xù)進一步黃龍病菌檢測，與以前報道的柑桔木虱快速制樣方法[4-6]相比，耗時更短，操作更簡便。本研究還比較了CaLas的3種LAMP檢測方法，發(fā)現以假定蛋白為靶標的LAMP法靈敏度最高[10]，且擴增所需時間最短?？赡苁怯捎谠摲椒ㄔ黾恿谁h(huán)引物，提高擴增效率，減少了擴增時間。通過比較分析普通PCR、LAMP和qPCR法對田間樣品的檢測結果發(fā)現，普通PCR的陽性檢出率低于其他兩種方法，會存在漏檢現象；LAMP和qPCR的檢測結果一一對應，陽性檢出率完全一致。相比而言，LAMP方法的擴增時間短，對擴增儀器要求較低，因此更適用于基層檢測部門。

本研究將快速裂解制樣與LAMP技術相結合，裂解制樣10 min，LAMP擴增30 min，直接熒光顯色觀察結果，在45 min內即可完成單頭柑桔木虱樣品的檢測，操作簡便，縮短了病原檢測時間，為病害傳播介體檢測提供了一種快速、可靠的方法。