劉紅艷，王婧潔，張慧芳，黨旭紅，王 超，張忠新，張睿鳳，原雅藝，任 越，董娟聰，柴棟良，李幼忱

中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西 太原 030006

隨著我國(guó)核技術(shù)應(yīng)用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，電離輻射對(duì)人類健康的影響越來(lái)越受到重視。α粒子由于具有較高的傳能線密度(LET)，會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的相對(duì)生物效應(yīng)能(RBE)，它對(duì)人體健康的影響一直是職業(yè)健康中關(guān)注的重點(diǎn)[1-4]。超鈾核素在核材料生產(chǎn)、MOX燃料制造、乏燃料后處理以及高放廢物處理與處置中對(duì)人體健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。超鈾核素半衰期長(zhǎng)，比活度高，人體內(nèi)負(fù)荷小，主要考慮通過(guò)吸入或從皮膚進(jìn)入體內(nèi)后產(chǎn)生的α粒子輻射能量沉積對(duì)組織器官的影響，肝臟是其重要的靶器官[7-8]。眾所周知，肝臟是人體代謝的主要場(chǎng)所，且?guī)缀跏蔷凭x的唯一場(chǎng)所，涉核工作人員的飲酒習(xí)慣是否會(huì)增加α粒子內(nèi)照射對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)，目前沒(méi)有足夠的人群流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)支持[9-12]。在α粒子內(nèi)照射氡的健康評(píng)估中，已有流行病學(xué)研究表明氡與吸煙的聯(lián)合致肺癌作用存在協(xié)同效應(yīng)，與部分細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[13-16]。

因此本工作擬通過(guò)α粒子輻射體，建立體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，開(kāi)展α粒子輻射、酒精單獨(dú)作用和兩者聯(lián)合作用肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)水平探討單因素、聯(lián)合因素對(duì)人肝細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，為系統(tǒng)評(píng)價(jià)α粒子內(nèi)照射風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

LO2細(xì)胞是人正常肝上皮細(xì)胞構(gòu)建成的永生化細(xì)胞系，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 輻射源

蘇州大學(xué)241Am α粒子輻射源裝置，如圖1所示，α粒子源幾何尺寸為36 mm×4 mm，是有效直徑為20 mm的面源，其活度為5.7×106Bq，文獻(xiàn)[17]計(jì)算給出表面劑量率為0.138 Gy/min。面源與蓋玻片盤(pán)平行放置，兩者間距離為10 mm。

1.3 儀器和試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀，Thermo 公司；超潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀，Bio-Rad 公司；倒置相差顯微鏡，OLYMPUS公司；流式細(xì)胞儀，Beckman公司；高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司。

RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素，上海生工；Trizol(主要成分為苯酚，含有8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等抑制內(nèi)源和外源RNA酶)、RNA 反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒，天根公司；細(xì)胞周期試劑盒、CCK-8試劑盒，凱基生物；酒精，分析純，南京碧云天生物工程有限公司；Transwell板、Matrigel基質(zhì)膠，美國(guó)康寧公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) LO2人肝細(xì)胞在37 ℃恒溫5%(體積分?jǐn)?shù))CO2環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%，經(jīng)0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化，進(jìn)行1∶3傳代，傳代一次計(jì)1代(P1)，培養(yǎng)細(xì)胞瓶于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.4.2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖檢測(cè) 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖采用CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒理試驗(yàn)。首先制作人肝細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，并將肝細(xì)胞密度分別調(diào)整為每毫升1萬(wàn)個(gè)、2萬(wàn)個(gè)、4萬(wàn)個(gè)、8萬(wàn)個(gè)、16萬(wàn)個(gè)，每孔分別接種100 μL于96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。待接種細(xì)胞貼壁后，加入CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h后，采用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(OD)值。

1.4.3α粒子輻照劑量篩選 在文獻(xiàn)[18-19]調(diào)研的基礎(chǔ)上，初步確定了5個(gè)劑量點(diǎn)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行α輻照，劑量分別為0.05、0.10、0.25、1.00、2.00 Gy，根據(jù)輻照劑量=劑量率×輻照時(shí)間，α源的劑量率為0.138 Gy/min，計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)所需輻照時(shí)間分別為21.7、43.5、108.7、434.8、869.6 s，輻照前細(xì)胞接種于已消毒的玻片上，濾紙吸控細(xì)胞表面培養(yǎng)基，將貼有細(xì)胞的玻片面朝α源，置于α粒子輻射源裝置輻照區(qū)卡槽內(nèi)。輻照完成后，玻片直接放入培養(yǎng)基，待細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后進(jìn)行消化轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。對(duì)照組細(xì)胞同時(shí)置于玻片接受假輻照(0 Gy)，輻照后48 h進(jìn)行細(xì)胞增殖活力檢測(cè)，顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況，篩選合適的輻照劑量進(jìn)行后續(xù)α粒子輻照實(shí)驗(yàn)。

1.4.4酒精作用濃度篩選 在文獻(xiàn)[20-22]調(diào)研的基礎(chǔ)上，根據(jù)中國(guó)人群飲酒習(xí)慣，計(jì)算血液和肝臟代謝酒精濃度，初步采用酒精濃度(體積百分比)0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0% 和7.0%的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行肝細(xì)胞酒精作用24 h，結(jié)束后換成正常培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞增殖活力檢測(cè)，顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況，篩選合適的酒精濃度和作用時(shí)間進(jìn)行后續(xù)酒精作用肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4.5聯(lián)合作用方式及實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)α粒子輻射和酒精單因素作用模型，建立復(fù)合作用方式。實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(不進(jìn)行任何處理)；輻射組(單純?chǔ)亮Ｗ虞椪?；酒精組(單純酒精處理)；復(fù)合組(輻射組+酒精組，即細(xì)胞先經(jīng)α粒子輻照后再經(jīng)酒精作用處理)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞經(jīng)消化后進(jìn)行傳代，采用相同代數(shù)的各組細(xì)胞，且均處于40代以內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.6細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)

(1) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞周期是反映細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。采用PI染料進(jìn)行DNA染色，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞周期。用Multicycle for windows 32-bit軟件統(tǒng)計(jì)分析人肝細(xì)胞在G0/G1、S、G2/M這3個(gè)不同時(shí)期的細(xì)胞占比。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)3個(gè)平行樣，收集人肝細(xì)胞約1 × 106個(gè)，加入無(wú)水乙醇過(guò)夜固定肝細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)清洗細(xì)胞去掉乙醇；加PI染料，室溫避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測(cè)。

(2) 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)是反映細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的重要指標(biāo)。采用Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲能力。細(xì)胞遷移檢測(cè)：細(xì)胞接種于24孔板8 μm孔徑濾膜的chamber上室，下室加入500 μL含胎牛血清培養(yǎng)基，避免起泡產(chǎn)生。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組接種3個(gè)平行樣，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后終止，用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫染色，棉簽擦去上室內(nèi)膜上的細(xì)胞，將Transwell小室反過(guò)來(lái)底朝上，顯微鏡下觀察小室底膜上附著細(xì)胞，隨機(jī)選取5～10個(gè)視野，顯微鏡拍照，記錄圖像中細(xì)胞數(shù)量。檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力時(shí)，Transwell小室底部膜需要包埋 Matrigel基質(zhì)膠，將冰上緩慢溶解的Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按體積比1∶8稀釋后，加入小室底部，室溫待其凝固，再接種細(xì)胞懸液，其余步驟與細(xì)胞遷移檢測(cè)一致。采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行肝細(xì)胞數(shù)量自動(dòng)計(jì)數(shù)。

(3) mRNA分子水平表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Real-time qPCR)測(cè)定肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)mRNA表達(dá)水平。在文獻(xiàn)[23-25]調(diào)研的基礎(chǔ)上，根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank公布的序列，設(shè)計(jì)Real-time qPCR引物，結(jié)果列入表1。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞待生長(zhǎng)至80%～90%，用PBS沖洗3遍后，直接加入Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，并以此為模板進(jìn)行 Real-time qPCR 檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣，結(jié)果采用ΔΔCT法進(jìn)行分析。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果和討論

2.1 α粒子輻照劑量

LO2人正常肝細(xì)胞在含10%新生胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，呈上皮樣、多角型，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)。采用241Am放射源對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行不同劑量(0.05、0.10、0.25、1.00、2.00 Gy)α粒子輻照，輻照后48 h檢測(cè)肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，結(jié)果示于圖2。由圖2可知：與對(duì)照組(NC)比較，0.05 Gy組細(xì)胞活力差異不顯著(P>0.05)；0.10、0.25、1.00 Gy組肝細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組，差異不顯著(P>0.05)；2.00 Gy組肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝細(xì)胞接受2.00 Gy輻照后，連續(xù)培養(yǎng)72 h，50%的細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，出現(xiàn)明顯死亡。因此，選擇肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)幾乎不受影響的1.00 Gy輻射劑量進(jìn)行單因素α粒子輻照細(xì)胞，記為輻射組。

圖2 不同劑量輻照48 h后對(duì)肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響

2.2 酒精作用濃度

采用含酒精濃度(體積百分比)分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%和7.0%的細(xì)胞培養(yǎng)基作用于肝細(xì)胞，與對(duì)照組比較，結(jié)果示于圖3。由圖3可知：酒精作用24 h后，0.5%和1.0%酒精作用組肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)；2.0%和3.0%酒精作用組肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在作用5 min后，長(zhǎng)梭型貼壁細(xì)胞變圓，4 h 后形態(tài)恢復(fù)正常；4.0%～7.0%酒精作用組肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于對(duì)照組。因此，選擇肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)幾乎不受影響的1.0%酒精進(jìn)行作用，記作酒精組。

圖3 不同濃度酒精處理24 h后對(duì)肝細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響

2.3 α粒子與酒精聯(lián)合作用人肝細(xì)胞

在以上篩選的單因素輻射和酒精作用肝細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行α粒子輻照和酒精聯(lián)合作用，組成了復(fù)合作用方式：細(xì)胞先接受α粒子輻照后再經(jīng)酒精作用。輻照劑量為1.00 Gy/次，累計(jì)輻照兩次后經(jīng)酒精作用，采用含1.0%酒精濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每代進(jìn)行一次酒精處理，隔三天傳代一次。

2.4 細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)

2.4.1細(xì)胞周期 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞周期示于圖4。由圖4可知：與對(duì)照組比較，輻射組S期細(xì)胞比例增加(P<0.05)、G2/M期細(xì)胞比例減少(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；酒精組與復(fù)合組肝細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞比例均減少、S期細(xì)胞比例均增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輻射組與酒精組比較，G0/G1期細(xì)胞比例增加、S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)合組與輻射組比較，G0/G1期細(xì)胞比例減少、S期細(xì)胞比例增加，且有顯著性差異(P<0.05)，各組的肝細(xì)胞周期百分比結(jié)果示于圖5。由圖5可知：輻射組細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，DNA復(fù)制前的檢查修復(fù)需要更長(zhǎng)時(shí)間，與輻射致DNA損傷有關(guān)。與單因素組相比，復(fù)合組肝細(xì)胞G1期逃逸至S期，細(xì)胞周期失衡。

(a)——對(duì)照組，(b)——酒精組，(c)——輻射組，(d)——復(fù)合組

■——G0/G1，□——S，——G2/M

2.4.2細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量示于圖6。由圖6可知：與對(duì)照組比較，輻射組、復(fù)合組肝細(xì)胞均發(fā)生了細(xì)胞遷移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與酒精組比較，輻射組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，復(fù)合組發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量也均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.001)；與輻射組比較，復(fù)合組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，復(fù)合組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量最大，有著明顯的惡性轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，提示α粒子輻照后再進(jìn)行酒精處理，酒精增加了肝細(xì)胞的侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

(a)—(d)、(f)—(i)為顯微鏡成像圖片

2.4.3分子生物學(xué)效應(yīng) 用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(Real-time qPCR)的方法，檢測(cè)與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的抑癌基因p53和原癌基因mdm2、細(xì)胞粘附蛋白相關(guān)基因cdh1在mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果示于圖7。由圖7可知：與對(duì)照組比較，單因素和復(fù)合組細(xì)胞p53基因和cdh1基因在mRNA水平表達(dá)降低，mdm2基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與酒精組比較，復(fù)合組肝細(xì)胞p53、cdh1和mdm2基因表達(dá)有顯著差異(P<0.001)；與輻射組細(xì)胞比較，復(fù)合組細(xì)胞p53基因和mdm2基因表達(dá)有顯著差異(P<0.05)，提示α粒子和酒精均誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，復(fù)合作用明顯高于單因素作用，即輻照后酒精的作用促進(jìn)了肝細(xì)胞原癌基因mdm2的高表達(dá)和抑制了抑癌基因P53的表達(dá)，從分子水平介導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

■——NC，——酒精組，□——輻射組，——復(fù)合組

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)α粒子輻射和酒精均能誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，復(fù)合因素作用下肝細(xì)胞原癌基因mdm2高表達(dá)，抑癌基因p53和細(xì)胞粘附相關(guān)基因cdh1低表達(dá)，發(fā)生明顯的惡性轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。提示α粒子輻照后再進(jìn)行酒精作用的肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)增高，可能是酒精影響了肝細(xì)胞表面E型粘連蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞之間粘連性降低，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲。因此，在評(píng)價(jià)α粒子內(nèi)照射對(duì)健康的影響時(shí)需要考慮職業(yè)人員的飲酒習(xí)慣。