李麗芝， 周曉蘭， 唐北沙， 郭紀(jì)鋒

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，又稱震顫麻痹(Paralysis agitans)，以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動作遲緩和姿勢平衡障礙為主要特征。帕金森病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，研究認(rèn)為可能與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性作用等有關(guān)[1～4]，且有研究發(fā)現(xiàn)PD有家族聚集現(xiàn)象，提示PD發(fā)病與遺傳因素有關(guān)[5，6]。DJ-1是常染色體隱性遺傳性帕金森病的致病基因[1]，該基因于2003年首次被發(fā)現(xiàn)與早發(fā)性帕金森綜合征(autosomal recessive early-onset parkinsonism，AREP)有關(guān)[1]。臨床上，帶有DJ-1突變的帕金森患者表現(xiàn)為早發(fā)運動遲緩、肌強(qiáng)直和震顫，在疾病后期出現(xiàn)焦慮、認(rèn)知障礙等精神癥狀，對左旋多巴治療反應(yīng)良好[1，7，8]。

人DJ-1基因定位于1p36.23，長23.86 kb，編碼含189個氨基酸高度保守的DJ-1蛋白[1，7，9]。DJ-1蛋白在生理條件下形成二聚體，廣泛表達(dá)于胰腺、腎臟、骨骼肌等組織，腦組織則在黑質(zhì)、尾狀核、丘腦等與PD相關(guān)區(qū)域表達(dá)水平較高[10]。DJ-1參與機(jī)體感知并預(yù)防氧化應(yīng)激，其缺失會加重氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[11，12]。DJ-1目前在PD發(fā)病機(jī)制中的作用尚未闡明，Bonifati等發(fā)現(xiàn)DJ-1致病突變L166P可改變DJ-1在細(xì)胞內(nèi)的分布，將DJ-1定位到線粒體上，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，從而參與致病過程[1]。

SUMO-1也稱為PIC1(PML-interacting clone 1)，是一個101個氨基酸組成的多肽，與泛素具有低(18%)但顯著的同源性。SUMO-1修飾，稱為Sumoylation，與泛素化類似。在SUMO特異性蛋白酶與E1異二聚體酶、E2酶及E3酶共同參與下，經(jīng)過成熟、活化、轉(zhuǎn)移、連接、解離等過程完成SUMO化和去SUMO化，改變修飾蛋白的穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)定位[3，13，14]。SUMO-1底物蛋白多含有ΨKxE或者ΨKxD模塊(Ψ代表疏水氨基酸，K代表賴氨酸，x代表任意氨基酸，E代表谷氨酸，D代表天冬氨酸)[14]。DJ-1蛋白含有ΨKxE模塊，且已被證明為SUMO-1的底物。

目前已發(fā)現(xiàn)SUMO-1與DJ-1神經(jīng)變性中發(fā)揮作用，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)DJ-1的A39S突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)改變，如UGT2B7表達(dá)下調(diào)，可能與PD發(fā)病機(jī)制有關(guān)[15]，猜測SUMO-1和DJ-1 A39S可能參與PD發(fā)病[16，17]。本研究構(gòu)建DJ-1致病突變質(zhì)粒，探討SUMO-1和sumoylation對DJ-1細(xì)胞內(nèi)定位及PD發(fā)病機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pcDNA3.1-hygro(-)-SUMO-1；pEGFP-N1 vector；pcDNA3.1-myc-DJ-1-WT，pcDNA3.1-myc-DJ-1-A39S；pGEX-5x-1-DJ-1-K130R；PCMV-Flag-2A；QIAGEN-tip-100，QIAprep Spin；EcoR I、Xho I、BgⅠⅡ、SalⅠ、Hind III、BamH I核酸內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Pyrobest酶等；引物；COS-7 細(xì)胞株；pEGFP-N1載體；ECL試劑盒；DMEM；胎牛血清；胰酶；EDTA；Lipofectamine 2000；GFP單克隆抗體；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG；MitoTracker Deep Red 633；CY3-flag。

1.2 實驗方法

1.2.1 野生型、A39S突變型、K130R突變型、A39S-K130R雙突變DJ-1基因(pEGFP-N1-DJ-1-WT、pEGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R、pEGFP-N1-DJ-1-A39S-K130R)及SUMO-1基因(PCMV-Flag-SUMO-1)融合表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增目的基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物并切膠回收。雙酶切處理PCR純化產(chǎn)物并進(jìn)行測序驗證，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物。制備感受態(tài)JM109細(xì)菌，將5種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染JM109細(xì)菌，將細(xì)菌鋪于固體LB培養(yǎng)皿過夜，挑選白色克隆，手工法抽質(zhì)粒后采用雙酶切及DNA測序驗證目的片段是否成功表達(dá)。檢測后，取驗證后的陽性克隆菌液，培養(yǎng)提取質(zhì)粒并保存。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察DJ-1-EGFP融合蛋白的表達(dá)與分布 將COS-7細(xì)胞用培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化后接種在12孔板孔中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%～90%匯合時即可開始脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)1.2 μg質(zhì)粒DNA，3 μl Lipofectamine 2000。操作按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)載體后培養(yǎng)24 h，PBS洗一次，3.7%多聚甲醛固定后PBS洗3次。封片后用激光共聚焦顯微鏡斷層掃描并照相，用波長488 nm的激光激發(fā)。

1.2.3 熒光倒置顯微鏡觀察SUMO-1-Flag融合蛋白的表達(dá)與分布 接種、轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞同前，PBS洗3次；-20 ℃預(yù)冷甲醇固定10 min，PBS-T洗3次。加入0.2%Triton-PBS室溫孵育10 min，PBS洗4次。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1 h。加入與CY3聯(lián)合的抗Flag抗體(1∶250稀釋在封閉液中)，室溫孵育1 h，PBS洗5次，陰性對照不加抗體。加入1∶1000倍稀釋的Hoechst33258(稀釋在封閉液中)，室溫孵育10 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察和照相。CY3經(jīng)激發(fā)后發(fā)紅色熒光，Hoechst33258經(jīng)激發(fā)后發(fā)藍(lán)色熒光。

1.2.4 Western Blot檢測DJ-1-pEGFP-N1和SUMO-1-Flag融合蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，PBS洗3次，每孔加入60μl(按照12孔板進(jìn)行)2×loading buffer，孵育10 min，收集細(xì)胞裂解液。裂解液100 ℃水浴中變性10 min，冷卻后上樣跑膠。轉(zhuǎn)膜封閉后加一抗，洗去一抗后加二抗，洗去二抗后按ECL試劑盒說明書進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測。

1.2.5 熒光染色分析技術(shù)檢測突變DJ-1蛋白的細(xì)胞定位情況 配置MitoTracker Deep Red 633，接種、轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。COS-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入37 ℃預(yù)熱含有1.8 μM MitoTracker的培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育40 min。染色后固定COS-7細(xì)胞，后用PBS洗3次，加入0.2%的PBS-T，室溫孵育5 min，用PBS洗3次。封片后用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。用波長488 nm和637 nm的激光激發(fā)，GFP經(jīng)激發(fā)后發(fā)綠色熒光，MitoTracker經(jīng)激發(fā)后發(fā)紅色熒光，雙色疊加后為黃色熒光，即共定位部分。

1.2.6 免疫熒光和激光共聚焦激光顯微鏡觀察SUMO-1-Flag和EGFP-DJ-1融合蛋白在細(xì)胞中的共定位情況 接種、轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染分為pEGFP-N1和pCMV-Flag空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)組、pEGFP-N1空質(zhì)粒和pCMV-Flag-SUMO-1共轉(zhuǎn)組、pCMV-Flag空質(zhì)粒和pEGFP-N1-DJ-1共轉(zhuǎn)組及pEGFP-N1-DJ-1和pCMV-Flag-SUMO-1共轉(zhuǎn)組4組。培養(yǎng)24 h后用PBS洗3次，然后加入-20 ℃預(yù)冷甲醇固定10 min，用PBS-T洗3次。加入0.2%Triton-PBS室溫孵育10 min，然后用PBS洗4次。加入5%BSA封閉液室溫封閉1 h。加入與CY3聯(lián)合的抗Flag抗體(1∶250稀釋在封閉液中)，室溫孵育1 h，然后用PBS洗5次；陰性對照不加抗體。加入1∶1000倍稀釋的Hoechst33258(稀釋在封閉液中)，室溫孵育1 h。封片后用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。用波長488 nm和637 nm的激光激發(fā)，GFP經(jīng)激發(fā)后發(fā)綠色熒光，CY3經(jīng)激發(fā)后發(fā)紅色熒光，雙色疊加后為黃色熒光，即共定位部分。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的COS-7細(xì)胞系的建立 經(jīng)過轉(zhuǎn)染和篩選后，建立了穩(wěn)定表達(dá)野生型和A39S、K130R突變型、A39S-K130R雙突變DJ-1蛋白及SUMO-1的COS-7細(xì)胞。經(jīng)過測序、雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳驗證構(gòu)建質(zhì)粒序列正確。4種DJ-1表達(dá)質(zhì)粒均能表達(dá)DJ-1與EGFP的融合蛋白，而SUMO-1表達(dá)質(zhì)粒也可表達(dá)SUMO-1-Flag融合蛋白。

2.2 DJ-1-pEGFP-N1融合蛋白及SUMO-1-Flag融合蛋白的表達(dá)與分布 DJ-1蛋白廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，沒有明顯蛋白聚集物形成，野生型和各突變型相比無明顯差別，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1載體的對照組細(xì)胞在胞質(zhì)和胞核均有綠色熒光的表達(dá)。SUMO-1在細(xì)胞內(nèi)位于細(xì)胞核內(nèi)或核周的胞漿中，并且多以斑點狀形式存在，且Flag空載體未見有紅色熒光表達(dá)。

2.3 熒光染色分析技術(shù)檢測突變DJ-1蛋白的細(xì)胞定位情況 野生型和K130R型DJ-1蛋白部分分布在線粒體上，A39S和A39S-K130RDJ-1蛋白分布在胞漿中的則大部分轉(zhuǎn)移至線粒體上(見圖1)。即DJ-1基因致病突變改變了DJ-1蛋白的亞細(xì)胞定位，而EGFP沒有定位在線粒體上。

綠色為EGFP或DJ-1-EGFP融合蛋白，紅色為MitoTracker染色，示線粒體，黃色信號為兩種波長的熒光疊加所致，即共定位部分

2.4 免疫熒光和激光共聚焦激光顯微鏡觀察SUMO-1-Flag和EGFP-DJ-1融合蛋白在細(xì)胞中的共定位情況 四種DJ-1-EGFP蛋白均能正常表達(dá)和分布，pCMV-Flag空載體未見SUMO-1有表達(dá)，pEGFP-N1空載體未表達(dá)DJ-1。四種DJ-1-EGFP蛋白均與SUMO-1-Flag蛋白存在共定位信號，EGFP與SUMO-1沒有共定位，四種DJ-1-EGFP蛋白與pCMV-Flag也不存在共定位信號(見圖2)。

綠色為正常和突變的DJ-1-EGFP融合蛋白，紅色為SUMO-1-Flag融合蛋白，黃色信號為兩種波長的熒光疊加所致，即共定位部分

3 討 論

帕金森病(PD)是第二常見的神經(jīng)退行性疾病，大約10%的PD病例與遺傳因素有關(guān)[18]。DJ-1基因是遺傳性帕金森病致病基因之一，具有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、控制基因轉(zhuǎn)錄和抵抗氧化應(yīng)激等生理功能，但其導(dǎo)致PD發(fā)病機(jī)制尚未明確。SUMO-1與泛素具有顯著的同源性，但與泛素的生理功能不同，SUMO-1主要調(diào)控被修飾蛋白在細(xì)胞的分布、代謝及功能。DJ-1含有SUMO-1修飾底物-ΨKxE模塊，已確定為SUMO-1的底物蛋白[14]，研究表明sumoylation修飾可以干擾線粒體動力學(xué)，可能在PD的發(fā)病中起到作用[18]。Bonifati等研究也發(fā)現(xiàn)了DJ-1另一突變L166P致病突變會導(dǎo)致DJ-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生改變，從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體上，導(dǎo)致DJ-1蛋白及線粒體功能障礙，導(dǎo)致PD的發(fā)生[1]。A39S與SUMO-1是否也會導(dǎo)致DJ-1蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，引起DJ-1蛋白和線粒體功能障礙引起PD。

為了闡明DJ-1突變、DJ-1蛋白亞細(xì)胞定位、SUMO-1在PD致病機(jī)制中所起的作用，本研究構(gòu)建了pCMV-Flag-SUMO-1、pEGFP-N1-DJ-1-WT、pEGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R、pEGFP-N1-DJ-1-A39S-K130R五種真核表達(dá)質(zhì)粒。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種DJ-1蛋白中野生型及K130R突變型僅少部分分布于線粒體上，而A39S突變型及A39S-K130R型蛋白分布則由胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體上，這表明DJ-1致病突變A39S及A39S-K130R突變改變了DJ-1蛋白在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分布，并且主要轉(zhuǎn)移至線粒體上，可能引起DJ-1蛋白的結(jié)構(gòu)及功能改變及線粒體功能障礙[19～21]。免疫熒光共定位發(fā)現(xiàn)外源性過表達(dá)的SUMO-1蛋白及4種DJ-1蛋白均存在共定位信號，這表明DJ-1與SUMO-1之間可能存在相互作用。因此，SUMO-1與DJ-1之間的相互作用及A39S突變可能影響DJ-1在亞細(xì)胞水平上的分布，導(dǎo)致DJ-1轉(zhuǎn)移至線粒體，影響DJ-1及線粒體功能，引起PD的發(fā)生。但這僅僅只是猜測，本研究并未確定DJ-1與SUMO-1之間存在相互作用，也無法確定該相互作用對DJ-1的影響，而DJ-1轉(zhuǎn)移至線粒體上對DJ-1、線粒體及整個細(xì)胞的影響也尚未可知。

本研究雖然通過免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)DJ-1致病突變A39S會導(dǎo)致DJ-1蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，且SUMO-1與DJ-1可能存在相互作用，但是本實驗還是存在一些缺陷。首先，DJ-1蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體后對DJ-1蛋白結(jié)構(gòu)功能及線粒體功能的影響未作進(jìn)一步研究，而DJ-1蛋白與細(xì)胞內(nèi)其它細(xì)胞器的關(guān)系也缺乏進(jìn)一步的了解。其次，雖然通過免疫熒光共定位確定了SUMO-1與4種DJ-1蛋白之間都存在共定位信號，但是確定蛋白之間存在相互作用需要結(jié)合免疫熒光共定位及免疫共沉淀來驗證，且DJ-1蛋白在胞漿及胞核內(nèi)都廣泛分布，SUMO-1分布于細(xì)胞核內(nèi)及核周，可能存在假陽性結(jié)果，因此，需要進(jìn)一步免疫共沉淀結(jié)果才能確定SUMO-1與DJ-1之間存在相互作用。

綜上，本實驗成功構(gòu)建了能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SUMO-1、野生型、A39S突變型、K130R突變型及A39S-K130R雙突變型DJ-1的真核表達(dá)質(zhì)粒，在COS-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)幾種質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)DJ-1與SUMO-1存在共定位信號，提示兩者可能存在相互作用。最后，DJ-1致病突變A39S及A39S-K130R會使DJ-1蛋白從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體，為發(fā)現(xiàn)PD的發(fā)病機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。