楊 露，譚會(huì)澤，溫志芬，張祥斌，劉松柏，彭運(yùn)智，鄒 軼，陳 丹，韓敏義

(溫氏食品集團(tuán)股份有限公司農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 云浮 527400)

隨著社會(huì)的進(jìn)步和生活水平的提高，人們要求肉品質(zhì)不僅有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且要色香味俱全。肉中的風(fēng)味主要包括鮮味、甜味、咸味、酸味和苦味五大類，而肉類及其制品的鮮味主要取決于氨基酸和核苷酸兩大類物質(zhì)。1985年在美國(guó)召開(kāi)的第一次鮮味國(guó)際討論會(huì)上，確定了鮮味的概念，將谷氨酸鈉和5′-核糖核苷酸(5′-IMP、5′-GMP……)等化合物給予的獨(dú)特滋味稱為鮮味。研究證實(shí)，在畜禽肉中肌苷酸為鮮味最強(qiáng)的物質(zhì)，鳥(niǎo)苷酸和腺苷酸也發(fā)揮了鮮味作用，它們通過(guò)一系列的降解過(guò)程產(chǎn)生多種具有鮮味的代謝產(chǎn)物[1]。

目前用于雞肉中鮮味核苷酸的檢測(cè)方法有化學(xué)滴定法、紫外分光光度法和高效液相色譜法。化學(xué)滴定法測(cè)定偏差較大，紫外分光光度法只能測(cè)定樣品中總核苷酸的量，現(xiàn)在普遍利用高效液相色譜法測(cè)定禽肉中的單種鮮味核苷酸含量[2]。本研究通過(guò)分析鮮味核苷酸的化學(xué)特性，結(jié)合禽肉中鮮味核苷酸的提取方法，最終提煉出一套前處理簡(jiǎn)單方便快速且準(zhǔn)確度高的可測(cè)定禽肉中三種鮮味核苷酸的高效液相色譜方法。

1 方法原理

樣品中的鮮味核苷酸經(jīng)5%高氯酸溶液提取，再與氫氧化鉀溶液發(fā)生反應(yīng)生成化學(xué)狀態(tài)穩(wěn)定的鹽類物質(zhì)，采用高效液相色譜(紫外檢測(cè)器)測(cè)定，外標(biāo)法定量。

2 材料與方法

2.1 材料

取一定量新鮮肉雞胸肌樣品于-20℃條件下保存待用。

2.2 試劑

色譜純的甲醇，實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水，磷酸鹽緩沖溶液(pH 5.8)，無(wú)水磷酸二氫鉀，無(wú)水磷酸氫二鉀，高氯酸，5′-肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，5′-鳥(niǎo)苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)。

2.3 儀器及耗材

高效液相色譜(配有紫外檢測(cè)器)，渦動(dòng)儀，高速離心機(jī)，萬(wàn)分之一分析天平，十萬(wàn)分之一分析天平，超聲波清洗器，0.22 μm有機(jī)濾膜，pH值計(jì)，高速組織勻漿機(jī)等。

2.4 高效液相色譜條件

(1)色譜柱：TC-C18柱(5 μm,φ4.6 mm×250 mm)；

(2)柱溫：25℃；

(3)流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液+甲醇(95+5)；

(4)流速：0.60 ml/min；

(5)進(jìn)樣體積：20 μl；

(6)檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；

(7)梯度洗脫設(shè)置：0～10 min，99%磷酸鹽緩沖溶液和1%甲醇；12 min時(shí)，80%磷酸鹽緩沖溶液和20%甲醇保持6 min；2 min內(nèi)磷酸鹽緩沖溶液升至99%，再保持8 min。

2.5 樣品前處理

2.5.1試液制備

稱取攪碎、均質(zhì)的雞肉樣品2～3 g(精確到0.01 g)于50 ml離心管中，加20 ml在4℃冰箱中預(yù)冷1 h的5%高氯酸溶液，超聲波提取5 min，在4℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀物再加20 ml預(yù)冷的5%高氯酸溶液。重復(fù)上述步驟，合并所有上清液于50 ml錐形瓶中，并用0.5 mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至5.8。從調(diào)好pH值的提取液中準(zhǔn)確移取20 ml，定容到100 ml容量瓶中。取定容的試液適量經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測(cè)定。

2.5.2回收率測(cè)定

將5′-IMP、5′-GMP、AMP三種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試樣后，按2.5.1節(jié)提供的方法處理制備樣品溶液，以考察前處理對(duì)回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果計(jì)算

樣品中5′-IMP、5′-GMP、AMP三種鮮味核苷酸的含量Ci，按公式Ci=(CsAiV)/(Asm)計(jì)算。式中，Ci為樣品中各種物質(zhì)的含量，mg/g；Cs為標(biāo)準(zhǔn)工作液中各種物質(zhì)的濃度，mg/ml；Ai為樣品中各種物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的峰面積響應(yīng)值；As為標(biāo)準(zhǔn)工作液中各種物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的峰面積響應(yīng)值；V為樣品提取液的總體積,ml；M為樣品質(zhì)量,g。

測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留4位有效數(shù)字。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將三種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液配制成含5′-IMP為12.5、25.0、50.0、62.5、125.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，含5′-GMP和AMP為2.5、5.0、10.0、12.5、25.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按2.4節(jié)設(shè)定色譜條件進(jìn)行色譜分析，以各個(gè)物質(zhì)濃度為自變量(X)，相應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值為依變量(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明,濃度為12.5～125 μg/ml，5′-IMP濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程計(jì)算為：Y=39.939 530 1X-308.903 46，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。濃度為2.5～25.0 μg/ml，5′-GMP濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程計(jì)算為：Y=61.583 628 7X-96.722 597，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0。濃度為2.5～25.0 μg/ml，AMP濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程計(jì)算為：Y=76.170 150 8X-104.692 94，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 0。

3.3 回收率測(cè)定

將5′-IMP、5′-GMP、AMP三種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入試樣后，按2.5.1節(jié)提供的方法處理制備樣品溶液，以考察前處理對(duì)回收率的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三種物質(zhì)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 精密度測(cè)定

利用2.5.1設(shè)定條件測(cè)定一個(gè)雞肉樣品中三種核苷酸(5′-IMP、5′-GMP和AMP)的含量，測(cè)定5個(gè)平行，按2.4節(jié)設(shè)定條件進(jìn)行高效液相色譜分析。對(duì)三種核苷酸的保留時(shí)間及含量的重現(xiàn)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

利用建立的方法可較好的測(cè)定雞肉中5′-肌苷酸、5′-鳥(niǎo)苷酸和腺苷酸三種核苷酸的含量。與以往的實(shí)驗(yàn)方法相比，此法利用磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，分離效果好。利用超聲提取各種物質(zhì)的效率高，結(jié)果平行性好。從精密度測(cè)定結(jié)果看出，5′-肌苷酸含量和保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.165 6%和0.088 0%，5′-鳥(niǎo)苷酸含量和保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.257 3%和0.065 0%，腺苷酸含量和保留時(shí)間相對(duì)偏差分別為0.279 4%和0.052 0%，三種核苷酸類物質(zhì)的回收率測(cè)定結(jié)果在90.00%～108.00%，滿足檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。以上結(jié)果表明該方法具有較好的精密度和較高的準(zhǔn)確性，可用于大批量樣品中三種鮮味核苷酸含量的測(cè)定。

5 結(jié)論

利用高效液相色譜建立的測(cè)定雞肉中5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鳥(niǎo)苷酸(5′-GMP)、腺苷酸(AMP)三種核苷酸含量的方法前處理簡(jiǎn)單、快速、定性定量準(zhǔn)確、回收率較高、重現(xiàn)性好，達(dá)到了快速準(zhǔn)確檢測(cè)雞肉中鮮味核苷酸含量的要求。