廖 馨，楊明柳

(廣西科學(xué)院廣西紅樹(shù)林研究中心，廣西紅樹(shù)林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西北海 536000)

0 引言

紅樹(shù)林是生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶陸海交界處潮間帶的木本植物群落，是陸地向海洋過(guò)渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)，是維持近岸生物多樣性和生態(tài)安全的關(guān)鍵屏障[1]。我國(guó)現(xiàn)有紅樹(shù)林面積相對(duì)于1973年減少41%[2]，調(diào)查評(píng)估發(fā)現(xiàn)紅樹(shù)林減少的原因95%是由于人類活動(dòng)的影響[3]。其中，沿海城市的填海造地、港口建設(shè)、圍墾養(yǎng)殖等海岸工程是造成濱海濕地喪失和紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)退化的重要原因之一，也是最直接的原因[4]。國(guó)際學(xué)者主要關(guān)注海岸工程對(duì)濕地生物多樣性及生態(tài)過(guò)程的影響，側(cè)重于探索海岸工程引發(fā)的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者過(guò)去多局限于通過(guò)估算濕地面積、評(píng)估濕地功能退化等方法研究海岸工程對(duì)濱海濕地的影響[6]，近年來(lái)海岸工程與濕地功能喪失之間的關(guān)系研究也逐漸受到關(guān)注，如有文獻(xiàn)報(bào)道渤海灣、膠州灣、珠江口等地的圍填海對(duì)近岸底棲生物造成不同程度的干擾，大型底棲動(dòng)物、魚(yú)類的豐度和多樣性都有所下降[7-10]。不同生物的生理習(xí)性存在差異，對(duì)生態(tài)環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)不同，使得量化海岸工程對(duì)生物資源的影響十分困難，特別是在紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)外專門針對(duì)海岸工程影響紅樹(shù)林生物多樣性和生物量的基礎(chǔ)研究還較少。海岸工程疏浚和吹填的過(guò)程中產(chǎn)生大量懸浮泥沙，掩埋了紅樹(shù)林的呼吸根，導(dǎo)致紅樹(shù)死亡；泥沙導(dǎo)致水體混濁、溶解氧濃度降低，損害魚(yú)類鰓部的濾水和呼吸功能從而導(dǎo)致魚(yú)類死亡[10,11]；懸浮物造成水體透明度的下降，影響浮游植物的光合作用，進(jìn)而影響以浮游生物為食的大型底棲動(dòng)物的正常生長(zhǎng)；另外，許多大型底棲動(dòng)物幼體營(yíng)浮游生活，懸浮物堵塞幼體的鰓部致其死亡。紅樹(shù)林是眾多海洋動(dòng)物的繁殖場(chǎng)、幼體棲息地，底棲動(dòng)物幼體的死亡將影響紅樹(shù)林生物多樣性的可持續(xù)發(fā)展[12]。

環(huán)境DNA不僅包含實(shí)時(shí)的物種信息，而且還包含過(guò)去數(shù)日內(nèi)的物種信息[13]。因此環(huán)境DNA 是一個(gè)極有價(jià)值的信息載體，目前已被應(yīng)用于生物多樣性監(jiān)測(cè)[14,15]、特定物種生物量估測(cè)、珍稀物種發(fā)現(xiàn)、入侵物種監(jiān)控[16]、隱存種發(fā)現(xiàn)、群落系統(tǒng)發(fā)育重建、物種間食物鏈關(guān)系分析等領(lǐng)域[17-19]。相比傳統(tǒng)的直接采樣，環(huán)境DNA分析技術(shù)有著無(wú)創(chuàng)、高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。紅樹(shù)林作為一個(gè)關(guān)注相對(duì)較少的生態(tài)系統(tǒng)，環(huán)境DNA的技術(shù)應(yīng)用較少，廣西紅樹(shù)林研究中心在國(guó)際國(guó)內(nèi)率先應(yīng)用環(huán)境DNA技術(shù)開(kāi)展紅樹(shù)林的大型底棲動(dòng)物多樣性和物種生物量的研究，并在本論文中呈現(xiàn)初步應(yīng)用的結(jié)果。本研究利用環(huán)境DNA技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序及熒光定量PCR，分析海岸工程影響下死亡紅樹(shù)林、嚴(yán)重退化紅樹(shù)林、尚存活紅樹(shù)林以及對(duì)照組紅樹(shù)林4種樣地底棲動(dòng)物多樣性及優(yōu)勢(shì)物種生物量空間差異，旨在評(píng)估環(huán)境DNA技術(shù)在紅樹(shù)林底棲生物多樣性和生物量研究中的可行性，并揭示海岸工程對(duì)紅樹(shù)林底棲生物資源的影響，為評(píng)估海岸工程的生態(tài)效應(yīng)與紅樹(shù)林濕地生物資源保護(hù)提供理論數(shù)據(jù)及科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)無(wú)人機(jī)航拍和實(shí)地勘察的海岸工程周邊區(qū)域情況，設(shè)置采樣點(diǎn)如圖1所示，植被覆蓋度為0的死亡紅樹(shù)林樣地(以下簡(jiǎn)稱D樣地) 6個(gè)(圖1中D1-D6)，植被覆蓋度≤30%的嚴(yán)重退化紅樹(shù)林樣地(以下簡(jiǎn)稱ED樣地) 6個(gè)(圖1中ED1-ED6)，尚存活紅樹(shù)林樣地3個(gè)(以下簡(jiǎn)稱AL樣地) 3個(gè)(圖1中AL1-AL3)，紅樹(shù)林對(duì)照區(qū)樣地(以下簡(jiǎn)稱CK樣地) 3個(gè)(圖1中CK1-CK3)，每個(gè)樣地中設(shè)置10 m×10 m的采樣樣方，采樣點(diǎn)經(jīng)緯度見(jiàn)表1。2020年3月6日及7日在上述18個(gè)采樣樣方中各采集3份沉積物樣品，每份樣品為采集于10棵樹(shù)下1-5 cm表層的混合沉積物，約50 g左右，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室后凍于-20℃冰箱。同時(shí)，按照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》GB 17378.7-2007和《海洋調(diào)查規(guī)范》GB/T 12763.6-2007，進(jìn)行大型底棲動(dòng)物的采集：每個(gè)樣地設(shè)置4個(gè)小樣方，采用25 cm×25 cm定量樣方框，深度0-30 cm，采集沉積物，過(guò)篩后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大型底棲動(dòng)物的判讀和生物量、優(yōu)勢(shì)物種的計(jì)算。該方法在后述中簡(jiǎn)稱為傳統(tǒng)“樣方法”。

圖1 樣品采集地

表1 采樣點(diǎn)經(jīng)緯度

1.2 方法

1.2.1 環(huán)境DNA提取

每份樣品的沉積物用攪拌機(jī)混勻后凍干，稱取0.3 g，使用DNeasy Power soil試劑盒(Qiangen公司)提取沉積物環(huán)境總DNA，提取方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。使用Nanodrop One (Thermo Scientific公司)測(cè)定總DNA的濃度，分析A260/A280、A260/230數(shù)值，并電泳檢驗(yàn)DNA質(zhì)量。每份樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 優(yōu)勢(shì)物種選取

將所采集的定量樣品及時(shí)用75%酒精固定，待樣品完全固定后，進(jìn)行樣品鑒定和稱重，并計(jì)算大型底棲動(dòng)物的棲息密度、樣方平均生物量，根據(jù)生物量的排序選擇本項(xiàng)工作中的優(yōu)勢(shì)物種。

1.2.3 熒光定量PCR特異性引物設(shè)計(jì)

在Genbank中搜索優(yōu)勢(shì)物種的DNA條形碼序列，使用Primer3Plus設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)物種及內(nèi)參的熒光定量PCR引物，經(jīng)驗(yàn)證篩選后，得到本論文所用的引物。

1.2.4 相對(duì)生物量分析

將每個(gè)樣地提取的3份沉積物DNA混合，對(duì)優(yōu)勢(shì)物種及內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)使用RR42LR試劑盒(TAKARA公司)，實(shí)驗(yàn)體系為10 μL SYBR ExTaq mix，2 μL DNA，0.4 μL 正向引物，0.4 μL反向引物，7.2 μL 超純水，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)行程序如下：熱啟動(dòng)95℃，30 s；循環(huán)擴(kuò)增程序95℃，5 s，60℃，30 s，循環(huán)40次；熔解曲線程序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和作圖

熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法，本報(bào)告中數(shù)據(jù)處理和作圖使用Excel和GraphPad Prism 7.0軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用單因素t檢驗(yàn)。

1.2.6 高通量測(cè)序

為更好地進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取CK，AL，ED，D樣地各3個(gè)樣方，即12個(gè)樣方進(jìn)行高通量測(cè)序并研究調(diào)查區(qū)域生物多樣性。每個(gè)樣方取3份沉積物樣本分別按1.2.1方法提取沉積物總環(huán)境DNA后等量混合，使用針對(duì)線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ (COI)的通用引物mlCOlintF：5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′和jgHCO2198：5′-TAIACYTCIGGRTGICCRAARA-AYCA-3′[20]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增使用ABI 2720型PCR儀、TransStart Fastpfu DNA Polymerase (全式金公司)、20 μL反應(yīng)體系，以盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增和保證每個(gè)樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一為原則，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇35個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物切膠回收后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海凌恩生物公司進(jìn)行Illumina PE250 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。

1.2.7 生物信息分析

根據(jù)overlap關(guān)系，對(duì)Illumina PE250測(cè)序得到的PE reads進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾。區(qū)分樣本后進(jìn)行可操縱分類單元(Operational Taxonomic Units，以下簡(jiǎn)稱OTU)聚類分析和物種分類學(xué)分析，使用Usearch (v10，http://drive5.com/uparse/)進(jìn)行OTU的生物信息統(tǒng)計(jì)分析。采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì) 97%相似水平的 OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類水平：domain(域)、kingdom(界)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。通過(guò)Excel繪制不同分類水平下的群落結(jié)構(gòu)組份圖，并基于bray-curtis 算法分析樣本間群落組成的層次聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境DNA提取

提取18個(gè)樣方，每個(gè)樣方3個(gè)樣本的沉積物總DNA后，對(duì)AL、ED、D和CK樣地的DNA濃度、A260/A280和A260/A230數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如圖2a所示，相同重量的凍干沉積物所提取的DNA濃度由低到高為D

**P<0.01表示差異極顯著

2.2 優(yōu)勢(shì)物種選取

根據(jù)傳統(tǒng)“樣方法”的大型底棲動(dòng)物調(diào)查結(jié)果，將該區(qū)域所有樣方物種平均生物量進(jìn)行排序。表2所示為生物量排名前十的優(yōu)勢(shì)物種，其中6種為軟體動(dòng)物，4種為甲殼動(dòng)物，這10種物種生物量占總生物量的比例達(dá)到92.34%(該部分結(jié)果詳見(jiàn)本刊高霆煒等《海岸工程對(duì)北海鐵山港紅樹(shù)林大底棲動(dòng)物群落的影響》)。因?yàn)椴⒎撬斜碇形锓N都能查到DNA barcode的信息，所以根據(jù)Genbank中DNA barcode序列的情況，選取扁平擬閉口蟹(16S rRNA， genbank No.:AB002128.1)、明秀大眼蟹(16S rRNA，genbank No.:LC097096.1)、珠帶擬蟹守螺(18S rRNA，genbank No.:AM932846.1)和紅樹(shù)蜆(COI，genbank No.:MN849878)作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)對(duì)象(4個(gè)物種在表2中用加粗標(biāo)記)。

表2 傳統(tǒng)底棲調(diào)查方法得到的生物量排名前十的物種

2.3 熒光定量PCR

經(jīng)引物篩選，使用細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS作為內(nèi)參，檢測(cè)上述4種優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)生物量所用的引物如表3所示。

表3 引物列表

如圖3所示，兩種甲殼動(dòng)物DNA的相對(duì)表達(dá)量在D樣地和ED樣地中明顯降低。由于方差較大，明秀大眼蟹16S rRNA的相對(duì)表達(dá)量在各樣地間差異不顯著，但相對(duì)表達(dá)量的平均值有明顯差別，例如ED樣地的平均表達(dá)量相當(dāng)于AL樣地的50.6%，D樣地的表達(dá)量?jī)H相當(dāng)于AL樣地的16.08%。扁平擬閉口蟹的16S rRNA 的相對(duì)表達(dá)量在AL樣地和CK樣地這兩種相對(duì)健康的紅樹(shù)林樣地中與退化紅樹(shù)林中有顯著性差異，ED樣地和D樣地中的相對(duì)表達(dá)量較AL樣地中分別下降87.96%和72.06%。兩種軟體動(dòng)物的DNA相對(duì)表達(dá)量顯示出和甲殼動(dòng)物不一樣的趨勢(shì)：珠帶擬蟹守螺18S rRNA的相對(duì)表達(dá)量在ED樣地最高，D樣地和AL樣地差異不大，提示該物種在海岸工程脅迫下生物量幾乎沒(méi)有改變；紅樹(shù)蜆的數(shù)據(jù)和珠帶擬蟹守螺有相似處，紅樹(shù)蜆COI基因的相對(duì)表達(dá)量在AL樣地、ED樣地、D樣地中均比CK樣地高，其中AL樣地最高。

*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01表示差異極顯著

2.4 高通量測(cè)序OTUs數(shù)量

根據(jù)生物信息學(xué)比對(duì)結(jié)果，環(huán)境DNA中共得到4 651個(gè)OTUs樣地，能比對(duì)到29個(gè)門、100個(gè)綱、315個(gè)目、955個(gè)科、2 419個(gè)屬、4 046個(gè)種。將不屬于本研究關(guān)注范圍的細(xì)菌、真菌、浮游藻類的相關(guān)OTUs以及人、牛等物種造成的DNA污染剔除，并將讀數(shù)<100的OTUs也剔除，最后在門的水平上，CK樣地鑒定出14個(gè)，AL樣地鑒定出12個(gè)，ED樣地鑒定出14個(gè)，D樣地鑒定出10個(gè)；在綱的水平上，CK樣地鑒定出27個(gè)，AL樣地鑒定出27個(gè)，ED樣地鑒定出30個(gè)，D樣地鑒定出27個(gè)；在目的水平上，CK樣地鑒定出67個(gè)，AL樣地鑒定出77個(gè)，ED樣地鑒定出85個(gè)，D樣地鑒定出74個(gè)；在科的水平上，CK樣地鑒定出180個(gè)，AL樣地鑒定出187個(gè)，ED樣地鑒定出188個(gè)，D樣地鑒定出171個(gè)；在屬的水平上，CK樣地鑒定出254個(gè)，AL樣地鑒定出294個(gè)，ED樣地鑒定出287個(gè)，D樣地鑒定出296個(gè)；在種的水平上，CK樣地鑒定出290個(gè)，AL樣地鑒定出333個(gè)，ED樣地鑒定出316個(gè)，D樣地鑒定出350個(gè)(圖4)。各個(gè)樣地在各個(gè)分類水平上能鑒定出的OTUs數(shù)量并沒(méi)有顯著差異。

圖4 各樣地不同分類水平下OTUs數(shù)量(讀數(shù)≥100)

2.5 底棲生物物種群落結(jié)構(gòu)組成分析

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知一個(gè)或多個(gè)樣本在各分類水平上的分類學(xué)比對(duì)情況。其結(jié)果包含了兩個(gè)信息：樣本中含有何種OTUs；樣本中各分類水平上的OTUs序列數(shù)，即相對(duì)豐度。使用Excel對(duì)不同分類水平的群落結(jié)構(gòu)按百分比作圖。圖5a展示了簡(jiǎn)明分類組分圖，分類單元有：藻類、真菌/細(xì)菌、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。通過(guò)組分圖可以直觀地看出在各樣地中，屬于無(wú)脊椎動(dòng)物OTUs的序列數(shù)最多，ED、D兩個(gè)樣地的藻類、真菌的占比相對(duì)于CK、AL樣地較多，原因在于ED樣地和D樣地受到海岸工程的影響使其沉積物理化性質(zhì)發(fā)生改變，造成藻類和真菌的快速繁殖。圖5b按門水平展示了各樣地?zé)o脊椎動(dòng)物的群落結(jié)構(gòu)，相對(duì)豐度較高的門有節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、 環(huán)節(jié)動(dòng)物門(Annelida)、軟體動(dòng)物門(Mollusca)、刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)，其中ED、D樣地中環(huán)節(jié)動(dòng)物門所占百分比明顯比CK、AL樣地多，刺胞動(dòng)物也相對(duì)多，而CK和AL兩種尚存活紅樹(shù)林樣地以及對(duì)照紅樹(shù)林樣地中的軟體動(dòng)物占比相對(duì)更多。在脊索動(dòng)物水平上， D樣地的鳥(niǎo)綱OTUs序列顯著多，這一結(jié)果推測(cè)是因?yàn)镈樣地紅樹(shù)死亡，植被覆蓋度幾乎為0，所以鳥(niǎo)糞更易掉落到沉積物上而造成的，其余各樣地脊索動(dòng)物下屬各綱的群落結(jié)構(gòu)并沒(méi)有明顯的規(guī)律。輻鰭魚(yú)綱(Actinopterygii)和海鞘綱(Ascidiacea)在CK和AL樣地相對(duì)更多，CK2、AL2、ED1、ED3、D1樣方出現(xiàn)了較多的屬于哺乳動(dòng)物綱的序列(圖5c)。究其原因，追溯到科的水平，這幾個(gè)樣地注釋到了鼠科序列，鼠科的活動(dòng)隨機(jī)性較強(qiáng)，造成各樣地的哺乳動(dòng)物OTUs序列數(shù)沒(méi)有規(guī)律性。ED2樣地中兩棲綱(Amphibia)的OTUs序列占比高達(dá)95.12%，追溯其原因，顯示在科的水平該樣地有69 050條序列注釋到角花蟾科，占據(jù)ED2樣地脊索動(dòng)物OTUs總序列數(shù)的95.08%，推測(cè)因采樣時(shí)剛好采集到該科物種的排泄物或者卵，造成該科物種序列數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他樣地。因節(jié)肢動(dòng)物門的序列在各樣地中均占據(jù)較高比例，屬于優(yōu)勢(shì)類群，因此繪制節(jié)肢動(dòng)物門各綱的群落結(jié)構(gòu)組分圖(圖5d)。從圖5d中可以看出昆蟲(chóng)綱的序列在節(jié)肢動(dòng)物門中占比最高，從35.43%(ED2)到93.11%(AL1)；其次是軟甲綱(Malacostraca)，占比從0.88%(AL3)到51.05%(ED2)。

圖5 物種組成結(jié)構(gòu)示意圖

2.6 樣本聚類樹(shù)

將每種樣地3個(gè)樣方門水平上的OTUs的序列數(shù)平均后，通過(guò)bray-curtis算法計(jì)算樣本間基于群落組成(門水平)的層次聚類分析。如圖6所示，左邊為聚類樹(shù)，右邊為群落結(jié)構(gòu)組分。圖6的物種囊括了高通量測(cè)序得到的所有門，包括細(xì)菌、真菌、藻類等。從圖6中可以看出，CK和AL聚類在一起，相關(guān)性最近，隨后是ED樣地，D樣地的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性最遠(yuǎn)。

圖6 樣本聚類樹(shù)與群落結(jié)構(gòu)組合分析

3 討論

3.1 環(huán)境DNA技術(shù)研究生物量變化的初步探討

環(huán)境DNA技術(shù)是一種新興的技術(shù)，該技術(shù)主要應(yīng)用于生物多樣性的調(diào)查、入侵物種和珍稀物種的監(jiān)測(cè)，也可用于水體環(huán)境中生物量的預(yù)測(cè)，例如魚(yú)類產(chǎn)量的預(yù)測(cè)等。在紅樹(shù)林研究中，尚未有人使用此技術(shù)對(duì)底棲生物的生物量進(jìn)行調(diào)查，本次研究是全球范圍內(nèi)首次在紅樹(shù)林中使用環(huán)境DNA技術(shù)開(kāi)展生物量的研究。不同物種代謝能力不同，其釋放DNA至環(huán)境中的速率也不同，因此環(huán)境DNA還不適合研究整個(gè)環(huán)境中所有動(dòng)物生物量的變化。同種物種的不同個(gè)體向環(huán)境中釋放DNA的速率相似，因此環(huán)境中某物種的DNA表達(dá)量可提示生物量的多少。本研究選擇4種優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行相對(duì)生物量的研究，結(jié)果顯示退化紅樹(shù)林中，蟹類的相對(duì)生物量下降，提示海岸工程在疏浚和吹填施工過(guò)程產(chǎn)生了大量泥沙淤積，泥沙掩埋紅樹(shù)林的呼吸根，造成紅樹(shù)林的死亡，對(duì)蟹類的生境造成脅迫，蟹類的生物量受到影響。

將環(huán)境DNA中的相對(duì)生物量和傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果(詳見(jiàn)本刊高霆煒等《海岸工程對(duì)北海鐵山港紅樹(shù)林大底棲動(dòng)物群落的影響》)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩者整體變化趨勢(shì)相符，說(shuō)明環(huán)境DNA作為載體研究特定物種相對(duì)生物量的可行性和有效性。從數(shù)據(jù)比對(duì)中也可以看出環(huán)境DNA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：同期進(jìn)行的傳統(tǒng)“樣方法”調(diào)查表明，紅樹(shù)蜆只出現(xiàn)在存活紅樹(shù)林中，甚至只在其中一個(gè)樣地有發(fā)現(xiàn)，而通過(guò)熒光定量PCR可以看出多個(gè)樣地中檢出有紅樹(shù)蜆的基因。究其原因，傳統(tǒng)“樣方法”因采樣困難費(fèi)勞力，在10 m×10 m的樣方中僅挖掘25 cm×25 cm的小樣方，占樣方面積的0.0625%；而環(huán)境DNA技術(shù)因采樣方便，僅需數(shù)克沉積物，采樣可以覆蓋樣方內(nèi)的每棵樹(shù)，因此研究結(jié)果更為精確。

明秀大眼蟹作為一個(gè)在紅樹(shù)林灘涂很活躍的蟹類物種，傳統(tǒng)“樣方法”的結(jié)果顯示AL樣地和CK樣地中沒(méi)有采集到該物種樣本，但ED樣地和D樣地中生物量較高，該結(jié)果按照常理推斷是不合理的。本研究的結(jié)果顯示，AL樣地和CK樣地中明秀大眼蟹的生物量相對(duì)高于ED樣地和D樣地。兩種調(diào)查方法的結(jié)果不同，推測(cè)原因除了傳統(tǒng)“樣方法”采樣范圍小外，也在于蟹類活動(dòng)迅速，在傳統(tǒng)調(diào)查中可能缺失。

3.2 環(huán)境DNA結(jié)合高通量測(cè)序全面展現(xiàn)退化紅樹(shù)林底棲動(dòng)物多樣性

提取的環(huán)境DNA選擇不同的引物可以分析特定類群的物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)。本研究采用的是線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ的通用引物，這對(duì)引物主要針對(duì)后生無(wú)脊椎動(dòng)物設(shè)計(jì)，但高通量測(cè)序的結(jié)果顯示樣品中也包含了部分細(xì)菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。從生物信息學(xué)比對(duì)后得到的所有物種門類結(jié)果(圖5a)來(lái)看，D樣地中的藻類豐度百分比高達(dá)20.24%，遠(yuǎn)高于ED樣地中的6.85%、AL樣地的3.00%和CK樣地的1.84%，其中，D樣地硅藻門的相對(duì)豐度尤其高，占總藻類的99.42%。

為避免干擾項(xiàng)影響，把生物信息分析結(jié)果中的藻類、真菌、細(xì)菌以及一些明顯的干擾項(xiàng)(例如人、牛的DNA)去除，只對(duì)底棲動(dòng)物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。從OTUs的數(shù)量來(lái)看，各樣地能夠注釋到的各分類階層類群的數(shù)量并沒(méi)有顯著差異。從優(yōu)勢(shì)類群來(lái)看，節(jié)肢動(dòng)物門、環(huán)節(jié)動(dòng)物門和軟體動(dòng)物門在各樣地中占優(yōu)勢(shì)。從群落結(jié)構(gòu)來(lái)看，退化紅樹(shù)林的環(huán)節(jié)動(dòng)物門和刺胞動(dòng)物門的相對(duì)豐度高于AL和CK樣地，軟體動(dòng)物門的豐度則相對(duì)低于AL和CK樣地。

如前述，傳統(tǒng)“樣方法”采樣的隨機(jī)性更強(qiáng)，而環(huán)境DNA方法因多點(diǎn)采樣所以更能全面展現(xiàn)樣地的生物多樣性；環(huán)境DNA中能夠鑒定出魚(yú)類、鳥(niǎo)類以及哺乳動(dòng)物的鼠類甚至人類的序列，說(shuō)明環(huán)境DNA中不僅包括實(shí)時(shí)的物種信息，而且也包括一定時(shí)間內(nèi)在樣地中曾經(jīng)出現(xiàn)的物種。由于生境、大小不同的物種采樣方式/技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)有區(qū)別，并且也鮮有研究者能夠精通各種類群的形態(tài)分類學(xué)，傳統(tǒng)的紅樹(shù)林生物多樣性調(diào)查一般會(huì)分為浮游動(dòng)植物、游泳動(dòng)物、小型底棲和大型底棲動(dòng)物四大類，而環(huán)境DNA技術(shù)采集的是環(huán)境樣品，如水、沉積物甚至空氣等，對(duì)樣品采集和現(xiàn)場(chǎng)處理的要求不高，采集到的樣本包含環(huán)境內(nèi)所有的物種DNA在內(nèi)，分析人員通過(guò)開(kāi)放數(shù)據(jù)庫(kù)也容易得到所有類群的分子條形碼序列信息，通過(guò)生物信息學(xué)即可比對(duì)各類群的物種信息。綜上所述，環(huán)境DNA技術(shù)對(duì)生物多樣性的研究會(huì)更加全面。

3.3 環(huán)境DNA技術(shù)不足之處

環(huán)境DNA技術(shù)也有其不足的地方。第一，以本論文為例，有一部分通過(guò)傳統(tǒng)調(diào)查方法采集到的物種，在高通量數(shù)據(jù)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，這是由于生物信息學(xué)注釋依賴的是數(shù)據(jù)庫(kù)中已有物種的分子條形碼序列，而包括紅樹(shù)林在內(nèi)的濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)甚至海洋生態(tài)系統(tǒng)中的很多物種，并沒(méi)有上傳有效的分子條形碼信息。第二，一對(duì)通用引物并不足以覆蓋所有的生物類群，例如部分真菌、部分刺胞動(dòng)物的COI基因中含有內(nèi)含子，因此COI并不是鑒定真菌和此部分刺胞動(dòng)物的最優(yōu)條形碼基因；而且，海綿和刺胞動(dòng)物的進(jìn)化速率比其他兩側(cè)對(duì)稱的后生動(dòng)物慢10-20倍，COI基因的變異不足以實(shí)現(xiàn)科以下級(jí)別的鑒定。第三，目前在生物多樣性研究上，環(huán)境DNA技術(shù)主要應(yīng)用于水體如淡水湖泊和海洋中，而較少用于土壤/沉積物的多樣性研究，原因在于來(lái)源于水生動(dòng)物的環(huán)境 DNA 在區(qū)域水體中呈現(xiàn)高度均勻分布狀態(tài)，而沉積物中的環(huán)境DNA則隨機(jī)性較大，在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)各樣地?cái)?shù)據(jù)方差較大的現(xiàn)象。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)一步地自主擴(kuò)充濱海濕地生物的DNA barcode數(shù)據(jù)庫(kù)、設(shè)計(jì)針對(duì)不同類群的引物以及改進(jìn)采樣方式和生物信息學(xué)算法以去除干擾項(xiàng)，使得此項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)t樹(shù)林以及濱海濕地的生物多樣性進(jìn)行更加全面、準(zhǔn)確的科學(xué)研究，并努力形成標(biāo)準(zhǔn)化方法使之推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

環(huán)境DNA技術(shù)是一項(xiàng)新興的技術(shù)，已經(jīng)在各種生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性研究中廣泛開(kāi)展，但是在紅樹(shù)林中的應(yīng)用幾乎是空白。廣西紅樹(shù)林研究中心掌握了基于環(huán)境DNA和宏分子條形碼技術(shù)的紅樹(shù)林大型底棲動(dòng)物多樣性研究方法，并一直在補(bǔ)充底棲物種的分子條形碼數(shù)據(jù)以完善該技術(shù)方法。本實(shí)驗(yàn)首次在紅樹(shù)林中以環(huán)境DNA技術(shù)開(kāi)展生物多樣性研究和優(yōu)勢(shì)物種生物量的研究。定量結(jié)果表明，海岸工程的脅迫對(duì)蟹類有顯著影響，對(duì)底棲貝類的影響不大；高通量測(cè)序得到的生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，海岸工程引起的退化紅樹(shù)林中底棲生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。和傳統(tǒng)調(diào)查方法結(jié)果的比對(duì)表明，環(huán)境DNA技術(shù)可以在紅樹(shù)林中研究生物多樣性和相對(duì)生物量的變化，并且比傳統(tǒng)調(diào)查方法的物種檢出率高，覆蓋度廣，可以涵蓋活動(dòng)能力強(qiáng)的物種。環(huán)境DNA技術(shù)采樣更加方便快捷，更適合于對(duì)固定樣地開(kāi)展生物多樣性和優(yōu)勢(shì)物種演替的持續(xù)性研究和監(jiān)測(cè)。