江波，陳林

1(長(zhǎng)江師范學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 涪陵，408100)2(湖南中醫(yī)藥研究院 中醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙，410013)

硒(Se)作為微量營(yíng)養(yǎng)元素是多種蛋白質(zhì)和酶必不可少的重要組成部分[1]?，F(xiàn)代流行病學(xué)研究表明，低Se水平與癌癥發(fā)病率增加之間存在關(guān)聯(lián)，缺乏一定量Se的攝入會(huì)導(dǎo)致心臟病、甲狀腺功能減退和免疫系統(tǒng)減弱[2]。聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)制定了成年人的膳食Se供給量為50～250 μg/d[3]，而我國(guó)有72%的地區(qū)處于缺Se狀態(tài)，因此，開發(fā)富Se農(nóng)產(chǎn)品具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。然而，F(xiàn)AO/WHO也同時(shí)制定了成年人膳食Se的最高安全攝入量為400 μg/d。大量攝入Se將產(chǎn)生劇毒已受到關(guān)注[4]，盡管確切的分子和生理機(jī)制尚未被完全揭示，但Se攝入過量可能會(huì)對(duì)造血系統(tǒng)、肺、腎、肝、膀胱和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生致癌作用[5]。為避免低濃度Se和高濃度Se產(chǎn)生的不利影響，準(zhǔn)確測(cè)定富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量具有重要意義。

目前，測(cè)定食品中Se含量的分析方法主要有原子熒光光譜(atomic fluorescence spectrometry，AFS)法[6-8]、原子吸收光譜(atomic absorption spectroscopy，AAS)法[9-11]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES)法和電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)法[12-15]。Se具有較高的第一電離能(9.75 eV)，即使在高溫電感耦合等離子體(inductively coupled plasma，ICP)中其電離度也不高，雖然采用ICP-MS可以直接測(cè)定食品中的Se，但Se的所有同位素均會(huì)受到多種質(zhì)譜干擾，必須使用碰撞/反應(yīng)池的反應(yīng)模式并選擇合適的同位素才能獲得較好的準(zhǔn)確度和靈敏度[16]；采用AFS、AAS和電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)直接測(cè)定富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量通常不能獲得足夠的靈敏度，由于Se的氫化物能更加有效地運(yùn)輸、霧化和激發(fā)，與傳統(tǒng)的液體霧化進(jìn)樣技術(shù)相比，能大幅度降低Se的檢出限(limit of detection，LOD)。因此，采用AFS、AAS和ICP-AES進(jìn)行Se的測(cè)定，最有效的方法是利用氫化物發(fā)生(hydride generation，HG)將Se還原為揮發(fā)性氫化物H2Se后進(jìn)行測(cè)定。然而，與使用高純Ar氣的ICP-OES、ICP-MS和AFS以及使用可燃性氣體的AAS相比，采用N2為等離子體氣源的微波等離子體原子發(fā)射光譜(microwave plasma atomic emission spectrometry，MP-AES)具有低成本優(yōu)勢(shì)，此外，MP-AES可提供與ICP-OES相媲美的分析性能，并且可避免使用可燃和氧化性氣體帶來的風(fēng)險(xiǎn)[17-19]，更適合氣體購(gòu)買困難或運(yùn)輸不便的偏遠(yuǎn)地區(qū)實(shí)驗(yàn)室使用。本研究采用MP-AES測(cè)定富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量，利用多模式樣品導(dǎo)入系統(tǒng)(multimode sample introduction system，MSIS)的氫化物發(fā)生模式使Se發(fā)生氫化反應(yīng)，提出了在線使用L-半胱氨酸/酒石酸為預(yù)還原劑提高Se(Ⅳ)還原效率從而提高氫化物發(fā)生效率的新策略，以期為富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量的低成本準(zhǔn)確測(cè)定提供高靈敏分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

100 mg/L的Se單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；NaOH(AR)、NaBH4(AR)、L-半胱氨酸(BR)、酒石酸(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；65%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸(亞沸蒸餾提純)、30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙氧水、37%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸，德國(guó)Merck公司；柑橘葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10020)、蒜粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10022)、扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10024)，中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所；富Se農(nóng)產(chǎn)品樣品(大米(產(chǎn)地重慶)、小麥(產(chǎn)地重慶)、茶葉(產(chǎn)地重慶)、玉米(產(chǎn)地重慶)、大蒜(產(chǎn)地山東)、小米(產(chǎn)地青海)、大豆(產(chǎn)地黑龍江)、黑木耳(產(chǎn)地黑龍江)，大型超市；實(shí)驗(yàn)用水為電阻率大于18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 4200微波等離子體原子發(fā)射光譜儀(配備MSIS霧化室、4107 氮?dú)獍l(fā)生器和SPS 3自動(dòng)進(jìn)樣器)，美國(guó)Agilent公司；MARs 5微波消解系統(tǒng)，美國(guó)CEM公司；泰斯特FZ102微型植物粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工作條件

MP-AES工作條件：霧化氣流量，0.35 L/min；等離子體觀測(cè)位置，0；泵速，20 r/min；讀數(shù)時(shí)間，5 s；重復(fù)次數(shù)，3次；樣品吸入延遲時(shí)間，20 s；沖洗時(shí)間，40 s；穩(wěn)定時(shí)間，30 s；Se分析波長(zhǎng)，196.026 nm；背景校正，F(xiàn)LIC。

微波消解系統(tǒng)工作條件：(1)最大輸出功率1 600 W，爬升時(shí)間3 min，控制溫度100 ℃，保持時(shí)間3 min；(2)最大輸出功率1 600 W，爬升時(shí)間7 min，控制溫度150 ℃，保持時(shí)間3 min；(3)最大輸出功率1 600 W，爬升時(shí)間5 min，控制溫度170 ℃，保持時(shí)間3 min；(4)最大輸出功率1 600 W，爬升時(shí)間5 min，控制溫度190 ℃，保持時(shí)間10 min。

1.3.2 樣品前處理

將收集的8種富Se農(nóng)產(chǎn)品(大米、小麥、茶葉、玉米、大蒜、小米、大豆、黑木耳)用超純水清洗干凈，瀝干水分后于80 ℃烘干至恒重，用微型植物粉碎機(jī)粉碎過40目篩，密封保存于干燥器中待用。

準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品于微波消解系統(tǒng)反應(yīng)罐內(nèi)，加入少量超純水潤(rùn)濕后，依次加入65%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸5 mL和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙氧水2 mL，浸泡過夜，按微波消解系統(tǒng)工作條件消解后，轉(zhuǎn)入錐形燒瓶中在電熱板上低溫趕酸至近干，用35%(體積分?jǐn)?shù))的鹽酸將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，搖勻后待測(cè)。采用與樣品相同的處理方式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)和空白溶液進(jìn)行處理。

1.3.3 MP-AES分析

MSIS霧化室的氫化物模式見圖1。由于僅需分析氫化物元素Se，將分析非氫化物元素的進(jìn)樣通道用堵頭密封，樣品溶液與預(yù)還原劑2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)L-半胱氨酸/4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)酒石酸在進(jìn)入MSIS霧化室之前利用三通接頭混合，經(jīng)制成線圈的毛細(xì)管均勻混合后進(jìn)入MSIS底部，還原劑1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)NaBH4/0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)NaOH溶液經(jīng)蠕動(dòng)泵頂部通道進(jìn)入MSIS頂部，在霧化室中樣品中的Se與NaBH4反應(yīng)生成H2Se后進(jìn)入MP-AES，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行分析。

圖1 用于氫化物模式的多模式樣品導(dǎo)入系統(tǒng)Fig.1 Multimode sample introduction system for hydride mode

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用MP-AES自帶的MP Expert 軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫化物發(fā)生條件優(yōu)化

在酸性條件下，NaBH4作為還原劑與酸反應(yīng)為氫化物發(fā)生提供氫源，考察了不同NaBH4添加量對(duì)發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖2-b。由圖2-b可以看出，隨著NaBH4添加量的增大，Se的信號(hào)強(qiáng)度也逐漸增大，當(dāng)NaBH4添加量超過1.0%后，Se的信號(hào)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，當(dāng)NaBH4添加量達(dá)到2.0%后，Se的信號(hào)強(qiáng)度開始下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1.5% NaBH4溶液為還原介質(zhì)，并加入0.5%的NaOH作穩(wěn)定劑。

圖2 氫化物發(fā)生反應(yīng)條件對(duì)Se信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of hydride generation reaction conditions on Se signal intensity

2.2 MP-AES工作條件優(yōu)化

為適應(yīng)復(fù)雜基質(zhì)體系的分析，MP-AES采用垂直觀測(cè)方式，不同分析元素的觀測(cè)位置可能會(huì)偏離中心觀測(cè)點(diǎn)以獲得更高的靈敏度和更好的檢出限。本實(shí)驗(yàn)考察了Se在不同觀測(cè)位置信背比(分析信號(hào)強(qiáng)度與背景信號(hào)強(qiáng)度的比值，SBR)的變化情況，通過選擇最大SBR來確定等離子體觀測(cè)位置。由圖3-a可以看出，Se的最大SBR位于等離子體中心觀測(cè)位置，表明Se的觀測(cè)位置沒有發(fā)生偏移，本實(shí)驗(yàn)選擇Se的觀測(cè)位置為中心觀測(cè)點(diǎn)0的位置。Se屬于難電離元素，而微波等離子體(microwave plasma，MP)的工作溫度比ICP低，意味著Se在MP中的電離效率比ICP更低，需要優(yōu)化霧化氣流量來提高Se的分析靈敏度，不同霧化氣流量下Se的SBR見圖3-b。由圖3-b可以看出，當(dāng)霧化氣流量為0.35 L/min時(shí)所對(duì)應(yīng)的SBR值最大。因此，本實(shí)驗(yàn)確定Se的最佳霧化氣流量為0.35 L/min。

圖3 MP-AES的觀測(cè)位置和霧化氣流量對(duì)Se信背比 的影響Fig.3 Effect of viewing position and nebulizer gas flow in MPAES on signal to background ratio of Se

2.3 光譜干擾與校正

MP-AES采用N2為氣源的磁激發(fā)等離子體，其等離子體溫度為5 000 K左右，遠(yuǎn)低于ICP溫度。因此，MP不能誘導(dǎo)Se完全電離，所產(chǎn)生發(fā)射光譜線的數(shù)量比ICP-OES少很多，可供選擇用于測(cè)定食品中Se元素分析特征的光譜線非常有限。通過自動(dòng)調(diào)用Se的預(yù)設(shè)波長(zhǎng)，掃描不同濃度的Se標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液發(fā)現(xiàn)，在196.026 nm處得到了對(duì)稱且無干擾的Se峰。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇196.026 nm為Se的分析波長(zhǎng)，不僅保證了分析靈敏度，而且避開了譜線重疊干擾。

由于Se經(jīng)氫化物發(fā)生反應(yīng)與基質(zhì)分離，所受到的基體效應(yīng)以及基質(zhì)成分影響所產(chǎn)生的背景干擾均可以忽略不計(jì)。然而，受MP光源本身所發(fā)射強(qiáng)烈雜散光的影響所產(chǎn)生的背景干擾仍然影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)選擇快速線性干擾校正(fast linear interference correction，F(xiàn)LIC)技術(shù)，分別測(cè)定空白溶液、Se標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)信號(hào)，通過高級(jí)光譜建模技術(shù)從原始光譜中自動(dòng)分離出Se信號(hào)，從而校正背景干擾。

2.4 方法的分析性能評(píng)價(jià)

2.4.1 方法線性關(guān)系與檢出限

采用100 mg/L的Se單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制0、5、20、50、100 μg/L的系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)MP-AES進(jìn)行測(cè)定，得到Se的校準(zhǔn)曲線方程為Y= 41.3X+0.15[其中：Y為信號(hào)強(qiáng)度，X為Se濃度(μg/L)]，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8，表明方法具有良好的線性關(guān)系。取連續(xù)測(cè)定11次空白溶液信號(hào)強(qiáng)度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度得到Se的LOD為0.58 μg/L，明顯低于已有類似研究的文獻(xiàn)報(bào)道[21]。

2.4.2 方法準(zhǔn)確性與精密度

為考察本方法的準(zhǔn)確性和精密度，分別采用本法和國(guó)標(biāo)GB 5009.93—2017的ICP-MS法[22]對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)柑橘葉(GBW10020)、蒜粉(GBW10022)、扇貝(GBW10024)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表1。采用本方法測(cè)定值與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的認(rèn)證值基本一致，并且與國(guó)標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果相吻合，RSD為2.3%～5.6%，驗(yàn)證了本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的分析結(jié)果(n=6)Table 1 Analysis results of national standard reference materials (n=6)

2.5 富硒農(nóng)產(chǎn)品分析

采用本方法和GB 5009.93—2017的ICP-MS法[22]分別測(cè)定了8種富Se農(nóng)產(chǎn)品(大米、小麥、茶葉、玉米、大蒜、小米、大豆、黑木耳)中總Se含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。由表2可見，本法與國(guó)標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果基本一致，不同富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量差別很大，農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量主要取決于其生長(zhǎng)的富Se環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)8個(gè)富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量為0.11～1.84 μg/g，總Se含量從大到小的排列順序?yàn)椋焊籗e茶葉>富Se玉米>富Se大豆>富Se大蒜>富Se小米>富Se黑木耳>富Se小麥>富Se大米。采用本方法測(cè)定富Se大米、富Se小麥、富Se茶葉、富Se小米、富Se黑木耳中Se含量與采用ICP-MS法的測(cè)定結(jié)果處于同一數(shù)量級(jí)[23-27]，富Se大蒜、富Se大豆中Se含量與采用HG-AFS法的測(cè)定結(jié)果處于同一數(shù)量級(jí)[28-29]，富Se玉米中Se含量與AAS法的測(cè)定結(jié)果處于同一數(shù)量級(jí)[30]，表明本方法完全能替代ICP-MS、HG-AFS和AAS法用于富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se的測(cè)定。

表2 富硒農(nóng)產(chǎn)品中Se的分析結(jié)果(n=6)Table 2 Results obtained for analytes selenium-enriched agricultural products (n=6)

3 結(jié)論

利用MP-AES法準(zhǔn)確測(cè)定了富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se的含量。富Se農(nóng)產(chǎn)品經(jīng)微波消解后在MSIS的氫化物模式下將Se轉(zhuǎn)化為H2Se進(jìn)行測(cè)定。通過在線加入預(yù)還原劑L-半胱氨酸/酒石酸，提高了Se的氫化效率，選擇Se在196.026 nm的光譜線為分析線并結(jié)合FLIC技術(shù)校正了光譜干擾，Se的LOD為0.58 μg/L。采用所建立的方法分析了八類富Se農(nóng)產(chǎn)品，總Se的含量為0.11～1.84 μg/g。本研究利用MSIS替代專用氫化物發(fā)生裝置，使用自帶的N2發(fā)生器為MP提供氣源，方法具有靈敏度高、安全可靠和運(yùn)行成本低的優(yōu)勢(shì)，大批量樣品連續(xù)快速測(cè)量的分析特性，為富Se農(nóng)產(chǎn)品中總Se含量的測(cè)定提供了高通量分析方法。