劉海浪 張立 胡婷婷 徐海燕

223300 淮安，南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院心內(nèi)科(劉海浪、胡婷婷、徐海燕)；210029 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(張立)

心力衰竭(heart failure，HF)是多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和(或)功能的異常改變，使心室收縮和(或)舒張功能發(fā)生障礙，從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征，它是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段[1]，死亡率和再住院率居高不下，發(fā)達(dá)國家的HF患病率為1.5%～2.0%，≥70歲人群的患病率超過10%。循證醫(yī)學(xué)研究表明，人口老齡化、高血壓、糖尿病、肥胖等相關(guān)危險因素控制不良導(dǎo)致全球HF的發(fā)病率仍在持續(xù)上升[2]。我國的最新研究表明，在過去的15年中HF的發(fā)病率增加了44%，其中>35歲的人群中有1.3%的人患有HF[3]。

已知微小RNA(microRNA， miRNA)是一類長約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[4]。相關(guān)研究證實，miRNA參與心肌梗死后心肌細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)缺血后的新生血管形成和心肌細(xì)胞的增殖，同時其以特定的方式參與心臟組織重構(gòu)、肥大、氧化應(yīng)激等HF的發(fā)生發(fā)展[5-6]。

鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白2(sodium-dependent glucose cotransporter 2，SGLT-2)本身主要在腎臟及小腸中表達(dá)，在心臟中幾乎不表達(dá)[7]。SGLT-2抑制劑是一種新型降糖藥物，卻被眾多大型臨床研究證實具有心臟保護作用，如EMPA-REG OUTCOME和CANVAS trial研究顯示，恩格列凈、坎格列凈能夠降低具有心血管高危風(fēng)險的2型糖尿病患者的死亡率和HF住院率[8-9]。達(dá)格列凈同樣可降低糖尿病合并HF患者的住院率及全因死亡率，并可改善非糖尿病患者發(fā)生缺血性HF的風(fēng)險[10-11]。但是，SGLT-2抑制劑改善HF預(yù)后的機制并不明確，同時對HF中miRNA表達(dá)影響未見報道，故本研究以結(jié)扎大鼠左前降支血管構(gòu)建HF模型，研究達(dá)格列凈對HF大鼠miRNA表達(dá)影響及探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，共21只，10周齡，體重為200～300 g，實驗動物嚴(yán)格遵照3R原則。

1.1.2 實驗試劑 達(dá)格列凈(10 mg/片)購自阿斯利康制藥有限公司；大鼠N末端B型利鈉肽原(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NT-proBNP)ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；miRNA引物設(shè)計及合成及SYBR Green實時熒光定量PCR預(yù)混液均購自上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司；miR-671激動劑、拮抗劑及空白對照購自廣州瑞博生物科技有限公司；Masson染液、無水乙醇、蘇木精、麗春紅等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及HF模型 將9只大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、 HF組、 HF+達(dá)格列凈組(HF+DAPA組)，每組3只，按照結(jié)扎左前降支血管方法建立缺血性HF模型，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，將大鼠麻醉滿意后，固定、備皮、消毒和鋪巾，距胸廓左尖端3～4 mm，打開胸腔，結(jié)扎左冠狀動脈前降支使用7-0絲線縫合，使用連續(xù)的6-0腹肌閉合胸部縫合，然后用4-0聚酯縫合線閉合皮膚。術(shù)后Sham組和HF組喂予安慰劑，HF+DAPA組喂予達(dá)格列凈(5 mg/d)，持續(xù)8周。

另外構(gòu)建12只HF大鼠，分為4組，每組3只，通過鼠尾靜脈分別注射miR-671激動劑(agomir-671)、抑制劑(antagomir-671)及空白對照(agomir-NC、antagomir-NC)。8周后檢測心臟功能及HF指標(biāo)。

1.2.2 大鼠心功能及NT-proBNP檢測 使用Vevo 770 UBM超聲心動圖檢查系統(tǒng)(VisualSonics Inc.，加拿大)檢測心功能。大鼠結(jié)扎左前降支血管手術(shù)用Avertin麻醉，使用直腸熱療儀監(jiān)測小鼠的體溫，并保持在36℃～38℃，心率維持在350～450 次/min，檢測左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening， LVFS)和左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。測量結(jié)束后脫頸處死大鼠開胸快速取出心臟標(biāo)本，置于液氮凍存于-80℃冰箱備用。

取鼠尾靜脈血2.0 ml，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測NT-proBNP濃度。用抗大鼠NT-proBNP單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的NT-proBNP與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠NT-proBNP，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測OD值，NT-proBNP濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本中NT-proBNP濃度。

1.2.3 miRNA芯片 取Sham組、HF組和HF+DAPA組的每組3只大鼠心臟組織，送杭州沃森生物公司，采用安捷倫科技的大鼠miRNA微陣列2.0(加利福尼亞州，圣塔克拉拉)進行芯片分析。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用在線網(wǎng)站http：//www.mirbase.org/index.shtml行同源性分析，miRNA靶標(biāo)預(yù)測采用在線靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫(TargetScan、PicTar、miRanda等)。

1.2.5 心臟組織形態(tài)學(xué)染色 各項檢查完成后，迅速取出心臟，PBS液洗去血液，濾紙洗凈水分后，用4%多聚甲醛固定24 h后分別石蠟包埋。每組各取3張5 μm的病理切片作HE染色及Masson染色，每張切片在低倍鏡10倍視野下觀察形態(tài)改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠HF指標(biāo)檢測

在結(jié)扎左前降支血管后8周，Sham組未出現(xiàn)心臟形態(tài)及功能變化，HF組和HF+DAPA組均見左心室明顯擴大(圖1)。超聲心動圖顯示LVEDD增大，LVEF和LVFS下降，NT-proBNP水平升高(均為P<0.05)。與HF組比較，HF+DAPA組的左心室擴大幅度較小，NT-proBNP水平較低，LVEF和LVFS增加，而LVEDD減小(均為P<0.05)，見圖2。

圖1 第8周3組大鼠的心臟形態(tài)學(xué)比較

NT-proBNP：N末端B型利鈉肽原；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；LVFS：左室內(nèi)徑縮短分?jǐn)?shù)；LVEDD：左室舒張末期內(nèi)徑；與HF組比較；a P<0.05，b P<0.01圖2 Sham組、HF組和HF+DAPA組的大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 達(dá)格列凈對HF大鼠心臟miRNA表達(dá)影響

2.2.1 miRNA芯片結(jié)果 與Sham組和HF組比較，HF+DAPA組大鼠的miRNA表達(dá)存在明顯差異，按照組間差異大、組內(nèi)差異小原則篩選，以HF組為對照組，HF+DAPA組中差異低表達(dá)1.5倍以上的miRNA有341條，差異高表達(dá)1.5倍以上的有754條，差異低表達(dá)3倍以上的有25條，差異高表達(dá)3倍以上的有13條(圖3)。

圖3 Sham組、HF組和HF+DAPA組的大鼠心臟中差異表達(dá)的miRNA

2.2.2 定量PCR驗證 在差異表達(dá)3倍以上的miRNA中選擇10條miRNA進行RT-PCR驗證，其結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)趨勢基本一致，提示芯片實驗的數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。其中差異表達(dá)5倍以上的有6條miRNA，分別為rno-miR-3588、rno-miR-878、rno-miR-743a-3p、rno-miR-3584-3p、rno-miR-6317和rno-miR-671(圖4)。

圖4 實時定量RT-PCR驗證差異miRNA的表達(dá)

2.2.3 miR-671對心功能影響 在HF組中通過鼠尾靜脈注射miR-671激動劑(agomir-671)及抑制劑(antagomir-671)，發(fā)現(xiàn)agomir-671可增加NT-proBNP水平，降低LVEF、LVFS，增加LVEDD(均為P<0.05)，而antagomir-671組的LVEDD和NT-proBNP水平降低，LVEF和LVFS顯著增加(均為P<0.05)。

2.2.4 miRNA靶標(biāo)的生物學(xué)分析 針對microarray的差異表達(dá)基因、同時又被預(yù)測為miRNA調(diào)控靶標(biāo)

的編碼基因，取交集進行GO分析、Pathway分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異miRNA潛在靶基因的生物學(xué)功能與代謝、細(xì)胞凋亡等過程密切相關(guān)，涉及Ras、mTOR、表皮生長因素受體、AMPK等信號通路，提示這些miRNA對HF心肌細(xì)胞的能量代謝存在影響。

2.2.5 miR-671生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測

RT-PCR驗證的差異表達(dá)5倍以上的6條miRNA，利用在線網(wǎng)站進行生物信息學(xué)分析提示，它們普遍存在于哺乳類、禽類和魚類動物中，進化上高度保守。其中miR-671在人、鼠、豬、家犬等哺乳動物中核心區(qū)同源性高達(dá)100%，其序列的高度保守性提示該miRNA應(yīng)存在潛在、重要的作用。然后，借助在線靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫(TargetScan、PicTar、miRanda等)，根據(jù)miRNA與預(yù)測靶基因結(jié)合的評分排名，我們發(fā)現(xiàn)煙酰胺單核苷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶3(nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT-3)是miR-671的主要候選靶基因。

3 討論

HF的病理生理機制復(fù)雜。近些年研究闡明了其發(fā)生發(fā)展涉及交感神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及炎癥因子激活，以及心肌細(xì)胞的凋亡、壞死、間質(zhì)纖維化和氧化應(yīng)激等相關(guān)機制，而心肌細(xì)胞能量代謝異常貫穿HF的整個發(fā)展過程[12]。針對HF的藥物治療，研究表明黃金三角(血管緊張素受體抑制劑、β受體阻滯劑和醛固酮受體拮抗劑)可以降低左室射血分?jǐn)?shù)下降的HF患者的住院率和死亡率[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，沙庫巴曲纈沙坦鈉使心血管死亡和HF住院風(fēng)險降低20%，心臟性猝死減少20%[14]。

SGLT-2抑制劑可降低糖尿病合并HF患者的住院率，降低死亡率，有改善HF預(yù)后的保護作用。此外，在非糖尿病HF患者中，SGLT-2抑制劑同樣具有改善HF患者生活質(zhì)量、提高活動耐量和降低再次住院率等作用[15]。我們研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈可以明顯改善心功能，改善HF指標(biāo)。既往有研究認(rèn)為，SGLT-2抑制劑通過降低高糖心臟毒性、心臟前后負(fù)荷等全身系統(tǒng)機制改善HF[16]；也有研究提示，SGLT-2抑制劑直接通過降低心臟炎癥因子激活、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡、改善離子通道及心肌能量代謝失衡的作用，從而達(dá)到抑制心臟重構(gòu)及改善心臟功能的作用[17-18]。此外，既往研究發(fā)現(xiàn)，在慶大霉素誘導(dǎo)的腎毒性大鼠模型中，達(dá)格列凈通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的miRNA起到保護腎臟的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HF大鼠中達(dá)格列凈影響心臟組織miRNA的表達(dá)，而眾多研究證實miRNA參與HF的發(fā)生發(fā)展，同時有研究表明坎格列凈、達(dá)格列凈能夠影響HF的線粒體能量代謝[20-21]，而我們的研究也證實，差異表達(dá)的miRNA的靶標(biāo)涉及最多的是能量代謝信號通路。有研究顯示，miR-378a-3p靶向結(jié)合核呼吸因子1，進而調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈及脂肪酸氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響調(diào)控線粒體能量代謝[22]；已有研究顯示，眾多miRNA(miR-15、miR-24、miR-499等)通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝，參與心肌細(xì)胞凋亡過程[23-24]，提示達(dá)格列凈可能調(diào)節(jié)能量代謝的miRNA，從而起到保護心臟的作用。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈下調(diào)miR-671的表達(dá)，而生物信息學(xué)分析顯示其序列具有物種保守性。功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-671時HF大鼠的心功能惡化，而低表達(dá)時心功能得到改善，說明miR-671可能參與HF的發(fā)展，為進一步探討其機制，我們通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測其靶標(biāo)是NMNAT-3。NMNAT是線粒體中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)生物合成的一種中心酶，催化從頭和挽救途徑[25]。目前，NMNAT已鑒定出三個亞型，各亞型在亞細(xì)胞定位和組織分布中均不同。NMNAT-3位于線粒體基質(zhì)中，是唯一已知的駐留在細(xì)胞器中的NAD合成酶，其主要功能參與線粒體能量代謝[26]。已有相關(guān)研究顯示，NMNAT-3通過減少細(xì)胞凋亡及壞死，改善神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷[27]。目前，僅有一篇文獻報道，NMNAT-3結(jié)合SIRT-3促進線粒體NAD合成，從而改善心肌肥厚[28]，但其在HF中的機制研究未見報道。我們的研究提示，miR-671可能通過上調(diào)線粒體中NMNAT-3表達(dá)，改善心肌細(xì)胞線粒體能量代謝，進而改善HF預(yù)后，但是具體機制仍有待進一步研究。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈影響HF大鼠心臟中miRNA的異常表達(dá)，明顯下調(diào)miR-671表達(dá)，而且低表達(dá)時可改善心功能，作用機制可能為通過介導(dǎo)NMNAT-3表達(dá)，調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體能量代謝。

利益沖突：無