汪 建 紅

(內(nèi)江師范學院 a.化學化工學院 b. 四川省高等學?！肮悘U棄物資源化”重點實驗室， 四川 內(nèi)江 641100)

臍橙是一種我國廣泛種植且消費量較大的營養(yǎng)豐富的水果[1-3].臍橙生產(chǎn)和使用過程中都會產(chǎn)生大量的臍橙皮，臍橙皮富含多種功能成分，色素是其中較為重要的一種[4-6].臍橙皮色素為天然色素，避免了很多合成色素具有的對人體健康不利的作用，適合于食品等領域的開發(fā)利用[7-10].提取并開發(fā)臍橙皮色素可擴大臍橙的應用范圍，提高其經(jīng)濟價值和社會價值.

色素提取方法眾多，有機溶劑直接浸提法[11-13]、酶法[14-16]、微波法[17-19]等均可用于色素提取，但或者提取效率較低,或者后處理復雜，耗時較長，或者不利于人體健康.內(nèi)部沸騰法[20-23]是一種先使有機溶劑進入植物組織內(nèi)部，再使其在組織內(nèi)部發(fā)生沸騰，從而對植物組織帶來沖擊，并加快組織內(nèi)外對流速度的一種提取方法，操作較為簡便，效率較高.因此本實驗采用減壓條件下使先通過浸泡進入植物組織內(nèi)部的低毒溶劑乙醇發(fā)生內(nèi)部沸騰的方法,提高臍橙皮色素的提取效率，并考察pH等對臍橙皮色素的穩(wěn)定性的影響,通過對色素提取液對羥基自由基清除率的測定考察其抗氧化性，為其開發(fā)利用提供基本參考依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：CS101-2AB 型電熱鼓風干燥箱(重慶試驗設備廠)；FA2204A型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；T-6型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；

試劑：無水乙醇、鄰菲羅啉、乙酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、30%過氧化氫，皆為分析純，成都金山化學試劑有限公司；95%乙醇，分析純，成都蜀都實業(yè)有限責任公司；硫酸亞鐵晶體、乙酸鈉晶體，皆為分析純，成都市科龍化工試劑廠.臍橙，產(chǎn)自重慶市奉節(jié)縣.

1.2 實驗方法

1.2.1 臍橙皮色素的提取和測定

低溫烘干臍橙皮并粉碎成粉末.參考文獻方法[24-25]，取1.0000 g臍橙皮粉末加入100 mL三頸燒瓶中，加入5 mL95%乙醇常溫浸泡30 min.迅速加入準備好的熱的50%乙醇溶液，裝好裝置，迅速抽真空到體系壓力為38 KPa左右，在該溫度下保溫回流.冷卻后，利用離心機離心15 min獲取清液.將清液在50 mL容量瓶利用30%乙醇溶液稀釋定容.

從上述50 mL容量瓶中準確移取2.00 mL液體到25 mL比色管中，并稀釋成10 mL，然后在文獻[26]記載的439 nm波長下測定其吸光度值.

1.2.2 單因素實驗

選擇液料比(V乙醇∶m臍橙皮)、溫度和時間3個因素，每次固定其中2個因素，只改變另1個因素，先后按照1.2.1步驟考查液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g)、溫度(40、50、60、70、80 ℃)和時間(10、20、30、40、50 min)對色素提取效果的影響.

1.2.3 響應面實驗

根據(jù)前面單因素實驗的結(jié)果，以該3個因素為因素，每個因素3個水平，以色素提取液吸光度值(R)為響應值，利用Box-Behnken設計法設計響應面模型和實驗方案，并按照方案安排實驗，重復1.2.1的操作.該模型的因素水平如表1 所示.

表1 響應面實驗因素水平

1.2.4 色素穩(wěn)定性實驗

分別使用pH=3,4,5,6,7,8,9,10的水溶液代替1.2.1中的水稀釋2.00 mL色素提取液到10 mL，常溫下放置3 h，在439 nm處測定其吸光度值.

1.2.5 抗氧化性實驗

取最佳條件下制得的未稀釋的色素提取液，然后按照文獻[13,27-28]中鄰二氮菲-硫酸亞鐵的方法測定該提取液對羥基自由基的清除率.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

在規(guī)定范圍內(nèi)固定液料比、溫度和時間3個因素中的2個因素，每次只改變另1個因素的情況下，測定液料比對色素提取液吸光度的影響(見圖1).

圖1 液料比對提取液吸光度的影響

從圖1可看到該曲線的最高點在液料比45∶1 mL/g處，折線前后隨著液料比的增加，提取液吸光度的變化趨勢分別是逐漸增加和逐漸減少.這是由于溶劑越多，能溶解浸出的臍橙皮色素越多；但由于所用溶劑乙醇溶液的濃度小于預先進入臍橙皮組織內(nèi)部的乙醇濃度，溶劑的增加也會使組織內(nèi)部的乙醇被稀釋，導致內(nèi)部沸騰激烈程度下降，這對提取是不利的[29].因此，選擇最高液料比45∶1 mL/g,測定溫度對提取液吸光度的影響(見圖2).

圖2 溫度對提取液吸光度的影響

從圖2可看到該曲線為隨溫度增加提取液吸光度從逐漸增加到逐漸減小的折線，該折線的最高點為60℃.這是由于：溫度的升高會使內(nèi)部沸騰更加劇烈，對臍橙皮組織沖擊更強烈，這對提取是有利的；但溫度過高易造成大量脂溶性雜質(zhì)和色素同時通過組織內(nèi)外對流通道，導致通道堵塞，也易增加減壓條件下溶劑的揮發(fā)量，這是對色素提取不利的[24,30-31].因此，選擇最佳溫度為60 ℃.

時間對提取液吸光度的影響如圖3所示.

圖3 時間對提取液吸光度的影響

從圖3可看到時間的延長導致了提取液吸光度的先增加后降低，在時間20 min時，吸光度最大.這是由于：時間越長，臍橙皮組織內(nèi)外的色素越趨于平衡，會有更多的色素進入溶液中，對色素提取來說是有利的，但時間的延長也會使揮發(fā)掉的乙醇逐漸增加，導致一些已溶解到溶液中的色素重新析出，對提取帶來負面影響[24,30-31].因此，最佳提取時間為20 min.

2.2 響應面實驗

以液料比(A)、溫度(B)和時間(C)為因素設計的響應面模型的實驗安排及結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示，響應面圖及等高線如圖4-6所示.

表2 響應面實驗方案和結(jié)果

表3 關于臍橙皮色素提取的響應面模型的方差分析

(a)等高線

(b)響應面圖4 液料比和溫度的等高線和響應面

通過對表2中數(shù)據(jù)的分析得出二次多項回歸方程為：

R=0.380+0.001A-0.005B-0.024C-0.011AB-0.006AC-0.023BC-0.031A2-0.120B2-0.018C2.

(a)等高線

(b)響應面圖5 液料比和時間的等高線和響應面

從表3還可看到一次項中液料比(A)、溫度(B)影響不顯著，時間(C)影響高度顯著；二次項中AB影響顯著，AC、C2影響不顯著，BC、A2和B2影響極顯著，且從F值大小還可看到各因素影響的先后順序為C>A>B，圖4-6也證明了此結(jié)果.

利用Design Expert 8.0 軟件還分析得出提取臍橙皮色素的最佳工藝條件為：液料比44.30∶1 mL/g，溫度61.73 ℃和時間10 min，該條件下色素提取液吸光度的理論預測值為0.341.考慮到實驗的可操作性，將條件優(yōu)化為：液料比45∶1 mL/g，溫度60 ℃和時間10 min，此條件下的理論預測值為0.335.在此優(yōu)化后的最佳條件下進行5次平行實驗得出吸光度平均值0.345(RSD=4.08%)，與理論預測值0.335的相對偏差為2.99%，也說明此模型是可靠的.且此平均吸光度值高于相同條件下有機溶劑直接浸提法的吸光度0.275，體現(xiàn)了內(nèi)部沸騰對色素提取的正面促進作用.

2.3 色素穩(wěn)定性和抗氧化性

稀釋后的色素提取液在439 nm處的吸光度如表4所示.

(a)等高線

(b)響應面圖6 溫度和時間的等高線和響應面

表4 pH對色素穩(wěn)定性的影響

從表4可看到由于臍橙皮色素中含有的部分黃酮類物質(zhì)結(jié)構中的內(nèi)醚鍵在酸性條件下被破壞，造成了色素吸光度的一定程度降低；而其中含有的酚羥基在堿性條件下轉(zhuǎn)化為氧負離子這種增色基團，導致了色素吸光度的增加.

此外，通過對色素提取液對羥基自由基清除率的測定，可得到該清除率為33.45%，說明臍橙皮色素具有一定的抗氧化活性，這可能是由于臍橙皮色素中存在相當量的黃酮類物質(zhì)，而黃酮恰恰具有較為優(yōu)良的抗氧化作用.此性質(zhì)使臍橙皮色素具有染色作用的同時，在抗氧化方面也具備一定的應用價值，對臍橙皮色素的開發(fā)利用是有重要意義的.

3 結(jié)論

本實驗利用單因素實驗及單因素實驗基礎上設計的響應面模型優(yōu)化內(nèi)部沸騰法提取臍橙皮色素的工藝條件，出于實驗可行性的考慮,修正后得到最佳提取條件為：液料比45∶1 mL/g，溫度60 ℃和時間10 min，此條件下的理論預測值為0.335.此最佳條件下5次平行實驗所得稀釋后提取液吸光度的平均值為0.345(RSD=4.08%)，與理論預測值0.335的相對偏差為2.99%；且此平均值高于相同條件下有機溶劑直接浸提法的吸光度0.275，體現(xiàn)了內(nèi)部沸騰對色素提取的正面促進作用.

穩(wěn)定性實驗表明酸性條件對臍橙皮色素穩(wěn)定性有一定程度的削弱，堿性條件具有一定的增色護色作用.對羥基自由基清除率的測定結(jié)果也表明臍橙皮色素具有一定的抗氧化活性，其對羥基自由基的清除率可達33.45%.