溫明博，林嘉恒，劉志龍，勞學(xué)軍

（暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510630）

原發(fā)性肝細胞癌（以下簡稱肝癌）是我國第四高發(fā)的惡性腫瘤，是第三大腫瘤致死原因，在消化道腫瘤中更是高居第二位［1－2］.近年來隨著分子靶向治療以及免疫治療的進展，肝癌的治療有了明顯的改善，但其發(fā)病率和死亡率仍較高，已嚴(yán)重影響我國人民生命健康［3］.因而，對于肝癌發(fā)生、發(fā)展以及治療的研究仍備受關(guān)注.有研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用［4－5］.人自噬相關(guān)基因ULK1和Beclin1可通過多種方式作用于自噬，其主要方式為影響自噬小體的形成，進而對自噬進行調(diào)控［6－7］，其受到PI3K-AKTmTOR信號通路調(diào)節(jié)，并參與調(diào)控多種腫瘤細胞.本研究通過采用qPCR和免疫組織化學(xué)方法，分別檢測ULK1和Beclin1在肝癌組織、癌旁組織以及正常肝臟組織中的表達情況，結(jié)合臨床病理相關(guān)因素，討論ULK1和Beclin1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及其之間的相互關(guān)系，以期為肝癌的診斷找到新的標(biāo)志物，治療找到新的靶點，進而提高肝癌的治療效果，延長肝癌患者的生存時間和生存率.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2015年3月至2018年6月標(biāo)本180例，其中肝癌組織及癌旁組織80對，正常肝臟組織20例.肝癌患者手術(shù)前均未采用放療、介入治療、局部治療或免疫治療，并術(shù)后病理切片證實為肝癌患者.

其中男性68例，女性12例；年齡26～86歲，中位年齡55歲；術(shù)前肝功能分級（Child-Pugh分級）A級62例，B級18例；乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性71例，陰性9例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）質(zhì)量濃度400μg／L及以上者46例，小于400μg／L者34例；嗜酒者22例，無嗜酒習(xí)慣者58例；腫瘤主體位于左肝者20例，右肝者60例；腫瘤按Edmondson-steiner分級：Ⅰ、Ⅱ級者51例，Ⅲ、Ⅳ級者29例；標(biāo)本腫瘤直徑5 cm及以下者40例，超過5 cm者40例.

1.2 試劑與儀器

兔抗人ULK1多克隆抗體、兔抗人Beclin1多克隆抗體（Novus Biologicals公司）；二抗及免疫組化試劑盒（DAKO公司）；檸檬酸抗原修復(fù)液及PBS緩沖液（武漢谷歌生物科技有限公司）；Trizol（TAKARA公司）；BestarTMqPCR RT kit（2220）及BestarTMqPCR MasterMix（2043）（DBI公司）；DEPC水（MACKLIN公司）.

超微量紫外分析儀（Quawell Technology公司，型號：Q6000UV）；紫外透射分析儀（上海嘉鵬，型號：ZF1-II）；正置熒光顯微鏡（日本尼康，型號：80i）；臺式低溫高速離心機（珠海黑馬，型號：1524R）；Real time PCR儀（ABI公司，7500）；PCR擴增儀（杭州晶格，K960）.

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中ULK1和Beclin1的蛋白表達

將各標(biāo)本石蠟切片放置于70℃烤箱中烘烤1 h；二甲苯中脫蠟3次（10 min／次），依次放入體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇和蒸餾水中浸泡5 min；然后，將切片放置入裝有濃度為10 mmol／L的枸鹽酸鈉緩沖液的高壓鍋中高壓修復(fù)10 min，冷卻至室溫，取出后用PBST緩沖液清洗3次（5 min／次）；覆以100μL內(nèi)源性過氧化氫阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBST緩沖液清洗3次（5 min／次）；覆以100μL封閉液（山羊血清），室溫下封閉1 h；去除封閉液，覆以100μL一抗4℃過夜；第2天取出后，室溫復(fù)溫，PBST緩沖液清洗3次（5min／次），覆以100μL對應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h，PBST緩沖液清洗3次（5 min／次）；滴加現(xiàn)配的DAB顯色液，蒸餾水清洗2次終止顯色；蘇木素染液5 min，鹽酸酒精中分化1 s，水流中反藍10 min；再依次放入蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)為75%、85%、95%、100%的乙醇中浸泡5 min，二甲苯中浸泡15 min，取出切片晾干后，用中性樹脂封片.

在肝癌組織、癌旁組織和正常組織中，分析ULK1和Beclin1的蛋白表達情況均采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，先采用200倍下整體觀察切片，在此切片中染色最佳位置使用400倍再次觀察6個視野，收集染色強度信息并進行評估.在鏡下當(dāng)陽性細胞在0%～10%、10%～25%，26%～50以及50%以上時，對應(yīng)評分為0分、1分、2分以及3分.當(dāng)染色情況在無染色、淺黃色、棕黃色以及棕褐色時，對應(yīng)評分為0分、1分、2分以及3分.在兩組數(shù)據(jù)相加數(shù)值大于2時評價為陽性，反之認為是陰性.

1.3.2 qPCR方法檢測肝組織中ULK1和Beclin1的mRNA表達

各組織標(biāo)本取出定量組織，加入液氮研磨后置入EP管中，Trizol試劑提取細胞中總RNA，超微量紫外分析儀檢測RNA濃度和純度，選取D（260 nm）／D（280 nm）處于1.8～2.0范圍內(nèi)溶液，用gDNA Eraser純化RNA，用BestarTMqPCR RT kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，用BestarTMqPCR MasterMix試劑，在ABIReal time PCR儀上進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系為2×BestarTMqPCR MasterMix 5μL，上游引物（10μmol／L）0.2μL，下游引物（10μmol／L）0.2μL，cDNA模板1μL（表1），去核糖核酸酶水3.6μL，每樣本設(shè)3個復(fù)孔，擴增條件為95℃5min，95℃10 s，60℃40 s，進行40個循環(huán).

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

本研究采用CT值統(tǒng)計法計算ULK1和Beclin1在各組標(biāo)本中的表達量（CT值為每個樣本通過不斷擴增能達到預(yù)定閾值所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)），其計算方法如下：ΔCT＝CT靶基因－CT內(nèi)參基因；ΔΔCT＝ΔCT實驗組－ΔCT對照組；標(biāo)本中ULK1或Beclin1的mRNA表達量＝2－ΔΔCT.

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計分析：ULK1及Beclin1 mRNA在肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織中的表達情況使用one-way ANOVA方法；ULK1及Beclin1蛋白在肝癌、癌旁組織、正常肝臟組織中的表達情況使用χ2檢驗方法；ULK1及Beclin1在肝癌中的表達與臨床病理因素相關(guān)性研究采用Pearson方法；ULK1和Beclin1在肝癌中蛋白表達相關(guān)性使用Spearman方法，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 ULK1和Beclin1蛋白在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達情況

ULK1蛋白在肝癌組織中陽性表達率是58%（47／80），癌旁組織中的陽性表達率是93%（75／80），正常肝組織中陽性表達率是85%（17／20）.肝癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中的表達具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），肝癌組織和癌旁組織的表達及肝癌組織和正常肝組織的表達之間均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），癌旁組織和正常肝組織之間的表達不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖1）.

圖1 ULK1在肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織中的陽性表達（×200）Fig.1 The positive expression of ULK1 in primary hepatic carcinoma tissues，paracancerous tissues and normal hepatic tissues（×200）

Beclin1蛋白在肝癌組織中陽性表達率是68%（55／80），癌旁組織中的陽性表達率是96%（77／80），正常肝組織中陽性表達率是95%（19／20）.肝癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中的表達具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），肝癌組織和癌旁組織的表達及肝癌組織和正常肝組織組組織的表達具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），癌旁組織和正常肝組織組的表達不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖2）.

圖2 Beclin1在肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織中陽性表達（×200）Fig.2 The positive expression of Beclin1 in primary hepatic carcinoma tissues，paracancerous tissues and normal hepatic tissues（×200）

2.2 ULK1和Beclin1 mRNA在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達情況

ULK1mRNA表達在肝癌組織與癌旁組織中、肝癌組織與正常肝組織中均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），在癌旁組織與正常肝組織中無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），肝癌組織中的表達低于癌旁組織和正常肝組織中的表達（圖3）.

圖3 ULK1 mRNA在正常組織、癌旁組織和肝癌組織中的表達情況Fig.3 Expression of ULK1 mRNA in normal hepatic tissues，paracancerous tissues and primary hepatic carcinoma tissues

Beclin1 mRNA表達在肝癌組織與癌旁組織中、肝癌組織與正常肝組織中均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），在癌旁組織與正常肝組織中無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），肝癌組織中的表達遠低于癌旁組織和正常肝組織中的表達（圖4）.

圖4 Beclin1 mRNA在正常組、癌旁組和肝癌組中表達情況Fig.4 Expression of Beclin1 mRNA in normal hepatic tissues，paracancerous tissues and primary hepatic carcinoma tissues

2.3 肝癌組織中ULK1和Beclin1蛋白表達之間的相關(guān)性

使用Spearman方法進行統(tǒng)計處理，得出ULK1和Beclin1在肝癌組織中的表達存在相互關(guān)系（P＝0.02），并可能表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系（r＝0.26，表2）.

表2 肝癌組織中ULK 1和Beclin1蛋白表達相關(guān)性Table 2 Correlation of ULK 1 and Beclin1 protein expression in hepatocellular carcinoma

2.4 肝癌組織中ULK1和Beclin1蛋白和mRNA表達與相關(guān)病理因素的關(guān)系

ULK1和Beclin1蛋白和mRNA均表現(xiàn)為與性別、年齡、HBSAg、術(shù)前肝功能分級、是否嗜酒、腫瘤的部位、腫瘤的分級無明顯相關(guān)性（P＞0.05）.Beclin1與腫瘤的大小、AFP具有相關(guān)性（P＜0.05），但ULK1僅與腫瘤大小具有相關(guān)性（P＜0.05），與AFP無明顯相關(guān)性（P＞0.05，表3）.

表3 肝癌組織中ULK1和Beclin1蛋白及m RNA表達與病理因素關(guān)系Tablie 3 Relationship between expression of ulk1 and Beclin1 protein and mRNA and pathological factors in hepatocellular carcinoma

3 討論

肝癌是臨床最常見的消化道惡性腫瘤之一，因肝癌的隱蔽性較強，僅有約20%的患者可早期診斷［8］.目前肝癌的首選治療手段仍為根治性的手術(shù)治療為主的綜合治療［9］，盡管隨著治療技術(shù)的發(fā)展，使其可切除性顯著增加，但肝癌死亡率仍很高［10－11］.因手術(shù)治療的局限性，人們開始對肝癌的非手術(shù)治療研究也逐漸深入，隨著介入治療、放化療治療、分子靶向治療等在臨床中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)多種治療方法相結(jié)合的綜合治療在腫瘤治療中可以取得更佳的治療效果.近年來隨著美國BMS公司生產(chǎn)的PD-1抑制劑在黑色素瘤以及其他惡性腫瘤治療中的良好效果，人們對免疫治療有了新的期待.目前研究認為人體的免疫機制和狀態(tài)對腫瘤的抑制、發(fā)生、發(fā)展起到了關(guān)鍵的作用［12］，細胞自噬是人體免疫機制重要的一環(huán)，其與腫瘤的關(guān)系極為密切［13－16］.

ULK1存在于高等哺乳動物細胞質(zhì)中，是酵母自噬起始因子Atg1的直系同源基因，其位點定位于人12號染色體，由28個特定的外顯子拼接組成，可編碼約1 050個氨基酸.ULK1在細胞質(zhì)內(nèi)主要與FIP200、mAtg13、Atg101結(jié)合形成復(fù)合體，并通過復(fù)合體的形式在自噬過程中發(fā)揮其生物學(xué)作用，當(dāng)其不表達時LC3的產(chǎn)生受阻，使自噬體無法形成.ULK1受到來自于mTOR的調(diào)控，當(dāng)mTOR受到來自于上游的激活信號后，活化的mTOR通過結(jié)合并磷酸化ULK1復(fù)合體，使ULK1復(fù)合體沉默，自噬小體的產(chǎn)生受阻，從而抑制了自噬的發(fā)生［17］.有報道，在乳腺、結(jié)腸、胃及前列腺惡性腫瘤中ULK1被下調(diào)，呈低表達水平［18］.Wu等［19］研究發(fā)現(xiàn)ULK1可通過作用于自噬，從而影響肝癌組織的生長繁殖.本研究中癌旁組織和正常組織與肝癌組織的ULK1的差異性表現(xiàn)，均主要表現(xiàn)為腫瘤組織中ULK1的表達下調(diào)，說明肝癌細胞可能通過抑制ULK1的表達抑制自噬的發(fā)生，從而讓肝癌細胞生長發(fā)育.Kaibori等［20］研究認為mTOR在肝癌中呈高表達狀態(tài)，同時隨著腫瘤的發(fā)展、增殖過程，mTOR的表達會進一步升高，mTOR過高表達的患者，在術(shù)后較為容易短時間內(nèi)復(fù)發(fā).mTOR的高表達可引起ULK1的表達下調(diào)，因此肝癌細胞中ULK1的低表達可能因為mTOR的高表達造成，并隨著腫瘤的逐漸增殖、體積增大，肝癌中的mTOR上調(diào)，隨之ULK1的表達也表現(xiàn)為進一步下調(diào).結(jié)合mTOR的過高表達可提示肝癌術(shù)后較快復(fù)發(fā)，以及mTOR對ULK1的作用，表明肝癌中ULK1的表達可能提示肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)趨勢.故肝癌中ULK1的表達情況可能可以提示肝癌的病情發(fā)展?fàn)顟B(tài)，也可能可以評估肝癌患者治療的預(yù)后及復(fù)發(fā)情況.

Beclin1存在于哺乳動物細胞，是酵母自噬相關(guān)因子Atg6的直系同源基因，其基因位點定位于人染色體17q21，其包含了約150 kb堿基序列，其需要12個指定的外顯子拼接而成，約450個氨基酸可被其翻譯而成.自噬體的形成與細胞內(nèi)Beclin1表達與否密切相關(guān)，細胞內(nèi)Beclin1主要是以復(fù)合體的形式存在，其可與PI3KC3結(jié)合并產(chǎn)生第二信使PIP3，同時也可與Vps34結(jié)合，其組成的復(fù)合體活化與否直接影響到自噬體的形成，影響了自噬的產(chǎn)生.有研究認為，在人類乳腺、宮頸等惡性腫瘤細胞中Beclin1被下調(diào)［21］，表現(xiàn)為低表達狀態(tài)，亦有研究認為Beclin1可通過自噬影響肝癌細胞的凋亡［22］.本研究中表現(xiàn)為肝癌組織較癌旁及正常肝組織Beclin1的表達下調(diào)，說明肝癌可能通過下調(diào)Beclin1的表達的方式，從而達到抑制自噬發(fā)生的目的，進而使肝癌細胞減少被自噬的影響，最終使肝癌細胞能夠進一步的增殖.趙堅培等［23］通過研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中Beclin1的表達呈腫瘤組織低于正常結(jié)腸組織，與腫瘤的生長浸潤程度有關(guān)，表現(xiàn)為T3、T4期腫瘤表達低于T1、T2期腫瘤.此結(jié)果和本研究結(jié)果相近，提示在結(jié)腸癌中與肝癌中Beclin1可能存在相同的作用機制.因此，結(jié)合本研究中Beclin1在肝癌組中表達低于癌旁組及正常組，可以認為Beclin1在腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲過程中飾演了重要角色，提示其在研究肝癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移等機制研究中可能具有提示及指導(dǎo)的價值，其在腫瘤中的表現(xiàn)或可能成為肝癌靶向治療藥物的作用新靶點，進而幫助肝癌治療提高的整體生存期.

本研究發(fā)現(xiàn)ULK1和Beclin1在肝癌組織中存在相互關(guān)系（P＝0.02），并可能表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系（r＝0.26）.表現(xiàn)為ULK1和Beclin1均在肝癌的發(fā)生、增殖、侵襲等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，同時兩者均可受到了來自于PI3K-AKTmTOR信號通路的調(diào)控，并在自噬的起始及形成過程中起到關(guān)鍵作用，同時其之間亦存在相互作用，Beclin1可受到ULK1的磷酸化作用，進而使Beclin1復(fù)合體受到影響，從而進一步在自噬過程中發(fā)揮作用.同時，本研究還證實，ULK1和Beclin1蛋白和mRNA均表現(xiàn)為與性別、年齡、HBSAg、術(shù)前肝功能分級、是否嗜酒、腫瘤的部位、腫瘤的分級不相關(guān).Beclin1與腫瘤的大小、AFP均相關(guān)，而ULK1僅與腫瘤大小相關(guān)，與AFP不相關(guān).

綜上所述，ULK1和Beclin1在肝癌自噬過程中發(fā)揮了重要作用.因此猜測或許將ULK1和Beclin1的表達上調(diào)，可能促使自噬體的生成增多，在增強自噬作用后，對肝癌細胞可進行更有效的殺傷，抑制或減少肝癌細胞的發(fā)展.但本研究存在一定的不足，接下來將進一步通過體外細胞實驗、動物實驗等系列研究，深度研究ULK1和Beclin1在肝癌中的作用機制以及與腫瘤的關(guān)系，可進一步幫助完善肝癌的產(chǎn)生機制，并可能為新的靶向治療位點供應(yīng)理論基礎(chǔ)，提升肝癌的臨床診療效果.

作者貢獻聲明

溫明博：設(shè)計實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；勞學(xué)軍：提出研究思路和框架，修改論文；林嘉恒：收集實驗標(biāo)本；劉志龍：收集實驗標(biāo)本.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.