石娜，賀倫，牛海濤，2*

（1.暨南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，廣東 廣州 510632）

絲素蛋白是從家蠶繭中提取的一種天然蛋白質(zhì)，可以形成膜狀［1］，由天然絲纖維通過(guò)脫膠去除免疫原性絲膠蛋白而得［2］，是蠶繭中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，脫膠后的絲素纖維具有高含量的結(jié)晶β-折疊結(jié)構(gòu)，可溶解于9.3 M溴化鋰等蛋白質(zhì)變性劑中，生成具有隨機(jī)螺旋結(jié)構(gòu)的絲素蛋白溶液［3］.絲素蛋白可加工成多種生物材料，如3D海綿、薄膜、水凝膠、納米纖維、納米和微粒子等.絲素生物材料無(wú)毒［4］、無(wú)免疫原性、生物相容性好［5］，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度［6］、降解性［5］和藥物控制性，在體內(nèi)具有生物安全性［7］，已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于人體某些醫(yī)療產(chǎn)品中.

絲素凝膠與其他聚合物凝膠不同，它可以通過(guò)超聲、渦流和電場(chǎng)等物理方法制備，具有良好的生物相容性、低免疫原性、可塑性、粘附性、促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)、低成本等優(yōu)點(diǎn)，非常適合作為組織工程生物材料［6］.將絲素溶于高濃度的中性鹽溶液中，得到的絲素水溶液可以制成粉末、絲素膜、凝膠和纖維等多種形態(tài).主要應(yīng)用于組織防粘連劑，促進(jìn)褥瘡修復(fù)，藥物緩釋載體，組織修復(fù)等方面［8－9］.本研究所采用的新型絲素凝膠是通過(guò)低分子量的液態(tài)聚乙二醇（PEG）來(lái)誘導(dǎo)、絲素蛋白溶液凝膠化形成的.凝膠和支架制備過(guò)程中所用的原料是絲素蛋白和醫(yī)用聚乙二醇（PEG400），制備方法簡(jiǎn)單，安全，綠色.PEG是常用的藥用輔料，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械和藥物的生產(chǎn)制備.PEG誘導(dǎo)的絲素蛋白凝膠成凝膠時(shí)間和凝膠力學(xué)性質(zhì)可控，具有優(yōu)異的可注射性，可作為組織填充材料和藥物、細(xì)胞包埋遞送載體，用于醫(yī)療美容、整形手術(shù)、藥物緩釋遞送等多領(lǐng)域.

近年來(lái)，絲素蛋白作為生物醫(yī)學(xué)支架材料也獲得廣泛的研究［10］，絲素支架的原料是大分子量絲素蛋白，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，形成的支架與膠原蛋白、透明質(zhì)酸等常用的天然生物材料相比，具有力學(xué)性質(zhì)可控、彈性好等優(yōu)點(diǎn)，是理想的組織修復(fù)支架、細(xì)胞培養(yǎng)載體及藥物緩釋載體［11］.本研究所采用的新型絲素蛋白支架除具有可供細(xì)胞長(zhǎng)入和遷移的200～300μm孔外，在孔壁上還含有大量的200～300 nm的納米孔，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的通透及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排出，與傳統(tǒng)的絲素蛋白多孔支架相比，更易促進(jìn)細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和分化［12－13］.本文主要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)絲素凝膠和絲素支架的生物相容性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探討，以便對(duì)絲素凝膠和絲素支架進(jìn)行初步的生物學(xué)評(píng)價(jià).

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

健康雄性新西蘭大白兔2.0～3.0 kg共30只（北京富龍騰飛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供）和C57BL／6雌性小鼠6～8周齡20～25 g（北京華阜康生物科技股份有限公司）.新西蘭大白兔飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所和暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，雌性C57BL／6小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)方案已得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的審批（NHT18003）、（NHT19002）與暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批（IACUC-20201224-02）.

絲素凝膠和絲素支架由蘇州絲美特生物技術(shù)有限公司提供.按照GB／T 16886.12標(biāo)準(zhǔn)制備浸提液，浸提介質(zhì)為生理鹽水，絲素凝膠和絲素支架按0.2 g／mL置于浸提介質(zhì)中，37℃震蕩（72±2）h，制成浸提液.

恒溫振蕩器IS-RDD3購(gòu)自美國(guó)精騏公司，流式細(xì)胞儀Facsymphony A5購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，液相芯片分析系統(tǒng)Luminex 200購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，酶標(biāo)儀Multiskan Go購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，羊抗鼠IgG和IgM 抗體和小鼠IgGUNLB 和 小 鼠 IgM-UNLB 購(gòu) 自 美 國(guó) Southern Biotech公司，96孔板購(gòu)自康寧公司，牛血清白蛋白和PNPP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Luminex 200 Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，流式抗體購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司.

1.2 研究方法

1.2.1 溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)絲素凝膠和絲素支架的溶血率

按GB／T16175.11-1996標(biāo)準(zhǔn)，健康成年大白兔6只，雄性，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，每只大白兔分別取新鮮兔血20 mL，加20 g／L草酸鉀1 mL，制備成新鮮抗凝兔血.取新鮮抗凝兔血8 mL，加入生理鹽水10 mL稀釋.取絲素凝膠和絲素支架浸提液、蒸餾水（陽(yáng)性對(duì)照）和生理鹽水（陰性對(duì)照）各10 mL于試管內(nèi).放入恒溫水浴中37℃保溫30 min后，每支試管加入0.2 mL稀釋的新鮮兔血，輕輕混勻，置于37℃水浴中繼續(xù)保溫60 min，750 g離心5 min，吸取上清液入比色皿內(nèi)，用分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度.根據(jù)公式計(jì)算各材料的溶血率，當(dāng)陰性對(duì)照組的吸光度＜0.03，陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度為（0.8±0.3）時(shí)實(shí)驗(yàn)有效，材料的溶血率≤5%時(shí)，表明材料不具有溶血作用.離心前，取0.02 mL血液與浸提液的混合液涂于載玻片，由于血細(xì)胞較少，不進(jìn)行涂片，待其干燥后，進(jìn)行瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照.本次實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)組成.

1.2.2 熱源實(shí)驗(yàn)檢測(cè)絲素凝膠和絲素支架的致熱性

按GB／T16175.12-1996標(biāo)準(zhǔn)及中國(guó)藥典二部1995，采用生理鹽水作浸提介質(zhì)，每種材料重復(fù)3只大白兔，共12只，雄性，體質(zhì)量2.3～2.7 kg.將大白兔裝于固定器內(nèi)，防止騷動(dòng)，實(shí)驗(yàn)前每隔30 min測(cè)體溫1次，共測(cè)2次，將體溫計(jì)插入大白兔肛門(mén)，深度約6 cm，測(cè)溫時(shí)間每只大白兔至少用時(shí)2 min，溫差不超過(guò)0.7℃，2次體溫平均值為該大白兔正常體溫.符合要求后，于測(cè)定其正常體溫15 min內(nèi)將材料浸提液溫?zé)嶂良s38℃，自大白兔耳緣靜脈緩慢注射規(guī)定劑量（1.0～2.0 mL／kg體重），注射完畢后每隔1 h測(cè)量體溫1次，共測(cè)量3次，以3次體溫中最高的1次減去正常體溫，即為該大白兔體溫的升高溫度.如3只大白兔中有1只體溫升高0.6℃或高于0.6℃，或3只大白兔體溫升高的總和達(dá)1.4℃或高于1.4℃，應(yīng)另取5只大白兔復(fù)試，檢查方法同上.本次實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)組成.

1.2.3 皮膚刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)絲素凝膠和絲素支架對(duì)皮膚的刺激作用

按GB／T16886.10-2000標(biāo)準(zhǔn)，選用健康成年大白兔3只，重復(fù)3只大白兔，共6只，雄性，體質(zhì)量2.0～3.0 kg.實(shí)驗(yàn)前4～24 h除去大白兔背部毛發(fā)，以生理鹽水作浸提介質(zhì)，取0.5 mL浸提液將紗布弄濕，在每只大白兔的脊柱左側(cè)去毛區(qū)前1個(gè)點(diǎn)斑貼陽(yáng)性對(duì)照（5%甲醛），中間1個(gè)點(diǎn)斑貼絲素凝膠浸提液，后一個(gè)點(diǎn)斑貼陰性對(duì)照（生理鹽水），大白兔的脊柱右側(cè)去毛區(qū)前1個(gè)點(diǎn)斑貼陽(yáng)性對(duì)照（5%甲醛），中間1個(gè)點(diǎn)斑貼絲素支架浸提液，后一個(gè)點(diǎn)斑貼陰性對(duì)照（生理鹽水），斑貼4 h后除去紗布并做好標(biāo)記，平行斑貼3只大白兔.除去紗布后24、48、72 h觀察皮膚反應(yīng)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分（表1），刺激反應(yīng)總評(píng)定：0.0～0.4分為極輕微刺激；0.5～1.9分為輕度刺激；2.0～4.9分為中度刺激；5.0～8.0分為重度刺激.本次實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)組成.

表1 皮膚刺激反應(yīng)記分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The grade scale for skin reaction

1.2.4 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)絲素凝膠和絲素支架對(duì)皮膚的刺激作用

按GB／T16886.10-2000標(biāo)準(zhǔn)，選用健康成年大白兔3只，重復(fù)3只大白兔，共6只，雄性，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，去除背部脊柱兩側(cè)被毛約10 cm×5 cm，在每只大白兔的脊柱左側(cè)去毛區(qū)前兩個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 mL陽(yáng)性對(duì)照液（5%甲醛），中間兩個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL絲素凝膠浸提液，后兩個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 mL陰性對(duì)照液（生理鹽水）；同一只大白兔右側(cè)去毛區(qū)前兩個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL陽(yáng)性對(duì)照液（5%甲醛），中間兩個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2 mL絲素支架浸提液，后兩個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL陰性對(duì)照液（生理鹽水），每點(diǎn)間隔2 cm，平行注射3只大白兔.注射后24、48、72 h觀察注射局部及周?chē)つw組織是否有紅斑、水腫反應(yīng)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分（表1），本次實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)組成.>

1.2.5 小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)絲素凝膠和絲素支架對(duì)小鼠免疫反應(yīng)的影響

選用6～8周齡C57BL／6雌鼠，麻醉后，將絲素凝膠和絲素支架分別植入小鼠背部皮下，用可吸收縫線縫合傷口（n＝3），設(shè)置模擬手術(shù)組作為陰性對(duì)照，即背部皮下不植入任何材料（n＝3）.植入材料1周后，頜下靜脈取血，待血液凝固后4 000 r／min、4℃離心后，獲得血清.植入材料5周后，用以上方法分離血清，血清用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、液相芯片分析系統(tǒng)、流式細(xì)胞法檢測(cè)絲素凝膠和絲素支架是否引起小鼠的免疫反應(yīng)異常，本次實(shí)驗(yàn)由兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)組成.

1.2.6 ELISA檢測(cè)小鼠血清總免疫球蛋白IgG和IgM水平

ELISA法檢測(cè)小鼠血清總IgG和IgM抗體水平，先用羊抗鼠IgG和IgM分別包被于96孔板，用牛血清白蛋白封閉后，將植入后1周和5周血清分別孵育1 h，再分別用小鼠IgG-UNLB和小鼠IgM-UNLB檢測(cè)，通過(guò)PNPP和碳酸氫鹽緩沖液顯色，用酶標(biāo)儀讀取405 nm波長(zhǎng)的吸光度.

1.2.7 液相芯片法檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度

植入后5周的小鼠血清通過(guò)Luminex 200 Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay試劑盒檢測(cè)血清IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-13，IL-17A，Eotaxin，GM-CSF，G-CSF，IFN-γ，TNF-α，KC，MCP-1，MIP-1α，MIP-1β和RANTES質(zhì)量濃度.按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，結(jié)果用BioRad軟件進(jìn)行分析.

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟和骨髓免疫細(xì)胞

植入材料5周后，安樂(lè)死小鼠，摘取脾臟，將脾臟研磨成單細(xì)胞懸液，脾臟和骨髓細(xì)胞分離方法同前面的研究［14］.流式抗體染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，數(shù)據(jù)用Flow Jo ver.10軟件進(jìn)行分析.

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

英國(guó)體育課程評(píng)價(jià)實(shí)施學(xué)校內(nèi)部評(píng)定與外部全國(guó)統(tǒng)一考試相結(jié)合，對(duì)于低年級(jí)的學(xué)生注重形成性評(píng)價(jià)和充分發(fā)揮性評(píng)價(jià)的采用，對(duì)于高年級(jí)的學(xué)生注重終結(jié)性評(píng)價(jià)的采用，教師則在各學(xué)段選擇與之相適應(yīng)的評(píng)價(jià)工具，如：測(cè)驗(yàn)、建立檔案和成績(jī)記錄等方式對(duì)學(xué)生的階段性成績(jī)進(jìn)行評(píng)定，呈現(xiàn)出教師評(píng)價(jià)的連續(xù)性。

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，采用GraphPad Prism 6進(jìn)行分析.數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，平行測(cè)量數(shù)據(jù)采用平行測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 絲素凝膠與絲素支架不產(chǎn)生溶血作用

陰性對(duì)照組的平均吸光度為（－0.030±0.020），各組吸光度值均＜0.03，陽(yáng)性對(duì)照組的平均吸光度為（0.835±0.106），各組吸光度值均在（0.8±0.3）范圍內(nèi)，表明實(shí)驗(yàn)有效.絲素凝膠和絲素支架的溶血率分別為4.239%和2.312%，均＜5%，表明這兩種材料體外實(shí)驗(yàn)均無(wú)明顯溶血反應(yīng)（表2）.光學(xué)顯微鏡下觀察各組血細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)絲素凝膠組與絲素支架組血細(xì)胞形態(tài)與陰性對(duì)照組相同，而陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，其血細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞形態(tài)不完整（圖1）.表明絲素凝膠與絲素支架不僅不產(chǎn)生溶血作用，對(duì)血細(xì)胞形態(tài)也無(wú)影響.

表2 溶血率測(cè)定結(jié)果Table 2 The results of hemolysis test

圖1 光學(xué)顯微鏡下血細(xì)胞形態(tài)圖（400×）Fig.1 Morphology of blood cells took by lightmicroscope（400×）

2.2 絲素凝膠和絲素支架符合熱源標(biāo)準(zhǔn)

注射兩種材料后大白兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只大白兔體溫升高總數(shù)低于1.4℃，認(rèn)為兩種材料符合熱源檢查要求，熱源實(shí)驗(yàn)合格（表3）.

表3 熱源實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of pyrogen reaction

2.3 絲素凝膠和絲素支架無(wú)刺激作用

2.3.1 皮膚刺激實(shí)驗(yàn)

通過(guò)浸有兩種材料浸提液的紗布進(jìn)行局部斑貼，除去貼敷物后，24、48、72 h觀察貼敷部位均無(wú)紅斑和水腫反應(yīng)，按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分，結(jié)果顯示兩種材料刺激后每只大白兔的刺激反應(yīng)都為0分，認(rèn)為兩種材料皮膚刺激實(shí)驗(yàn)合格（表4，圖2）.統(tǒng)計(jì)分析顯示，絲素凝膠和絲素支架浸提液斑貼后24、48、72 h紅斑和水腫評(píng)分均與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，斑貼后24、48、72 h紅斑評(píng)分均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01），斑貼后24、48 h水腫評(píng)分均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01），但72 h水腫評(píng)分均與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異.

圖2 絲素凝膠和絲素支架浸提液斑貼后24、48、72 h皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.2 The figures of skin irritation test at24，48 and 72 h after pasting silk fibroin gel and silk fibroin scaffolds extract

表4 皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of skin irritation reaction

（續(xù)表4）

2.3.2 皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)

大白兔皮內(nèi)注射材料浸提液后，24、48、72 h觀察均未見(jiàn)皮膚出現(xiàn)明顯紅斑和水腫現(xiàn)象，與陰性對(duì)照組的注射部位相似，最終記分均＜1.0，為無(wú)刺激，判斷兩種材料皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)合格（表5）（圖3）.皮內(nèi)注射絲素凝膠和絲素支架浸提液后24、48、72 h，紅斑和水腫評(píng)分均與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，注射后24、48、72 h紅斑和水腫評(píng)分均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01）.

圖3 皮內(nèi)注射絲素凝膠和絲素支架浸提液后24、48、72 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.3 The figures of skin irritation test at 24，48 and 72 h after injecting silk fibroin gel and silk fibroin scaffolds extract intracutaneously

表5 皮內(nèi)刺激記分Table 5 The results of intracutaneous reactivity

2.4 植入絲素凝膠和絲素支架對(duì)IgM、IgG水平的影響

絲素凝膠和絲素支架植入1周后，血清總IgG和IgM水平與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，植入5周后，絲素凝膠組血清總IgG水平比陰性對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），絲素支架組血清總IgM水平與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖4）.

圖4 絲素凝膠和絲素支架植入后血清總IgG和IgM水平Fig.4 The level of total serum anti-IgG and anti-IgM antibodies after implantation of silk fibroin gel and silk fibroin scaffolds

2.5 植入絲素凝膠和絲素支架對(duì)血清炎性細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

圖5 絲素凝膠和絲素支架植入后血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度Fig.5 The serum concentration of cytokines after implantation of silk fibroin gel and silk fibroin scaffolds

2.6 植入絲素凝膠和絲素支架對(duì)脾臟和骨髓免疫細(xì)胞的影響

絲素凝膠和絲素支架植入5周后，脾臟和骨髓細(xì)胞染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中嗜酸性粒細(xì)胞（CD45＋CD11b＋siglec-F＋Ly-6G－）、嗜中性粒細(xì)胞（CD45＋CD11b＋siglec-F－Ly-6G＋）、嗜堿性粒細(xì)胞（CD45＋D123＋CD117－）、B 細(xì)胞（CD45＋B220＋）、B1細(xì)胞（CD45＋CD19＋B220－）、B1a細(xì)胞（CD45＋CD19＋B220－CD5＋）、B2細(xì)胞（CD45＋CD19＋B220＋）、CD3＋T細(xì)胞（CD45＋CD3＋）、CD4＋T 細(xì)胞（CD45＋CD3＋CD4＋）、CD8＋T細(xì)胞（CD45＋CD3＋CD8＋）、巨噬細(xì)胞（CD45＋CD11b＋F4／80＋）和樹(shù)突狀細(xì)胞（CD45＋CD11b＋CD11c＋）的分布均與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明絲素凝膠和絲素支架對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的產(chǎn)生無(wú)顯著影響（圖6、7）.

圖6 脾臟免疫細(xì)胞表達(dá)情況Fig.6 Immune cell expression in spleen

圖7 骨髓免疫細(xì)胞表達(dá)情況Fig.7 Immune cell expression in bonemarrow cells

3 討論

在醫(yī)療器械中，與人體接觸、介入或植入體內(nèi)的醫(yī)療器械都存在一定的生物風(fēng)險(xiǎn)性，這類(lèi)醫(yī)療器械一般稱為生物材料和人工器官.植入材料用來(lái)替換或修復(fù)人體內(nèi)受損的組織，恢復(fù)退化器官的功能［15］，在醫(yī)學(xué)治療中占有舉足輕重的作用.它們直接或間接與人體的組織和血液相接觸，有的還要在體內(nèi)長(zhǎng)期使用，如人工心臟瓣膜、人工關(guān)節(jié)、人工乳房等都要在體內(nèi)植入幾十年［16］.醫(yī)療器械質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到使用者的生命安危，因此，在應(yīng)用于臨床前必須進(jìn)行一系列生物學(xué)評(píng)價(jià)，以保證其安全性［17］.生物相容性是指一種化合物不具有毒性或傷害性，不引起免疫排斥反應(yīng)，因而與活體組織或系統(tǒng)相容，稱為材料與宿主之間的相容性［18］.這種化合物植入組織后，能夠支持其植入組織中的生物材料與細(xì)胞相互作用［18］.植入材料的生物相容性取決于宿主和材料本身的各種因素，宿主因素包括生物種類(lèi)、遺傳物質(zhì)、植入位置和微環(huán)境；材料本身的因素包括材料的形狀、大小、表面的化學(xué)物質(zhì)和粗糙度、設(shè)計(jì)、形態(tài)和孔隙、組成成分、無(wú)菌狀態(tài)、接觸時(shí)間和降解時(shí)間等［19－20］，有研究表明，不同給藥途徑也能影響生物材料的相容性［21］.生物相容性的主要要求是該材料不能通過(guò)化學(xué)和生物惰性對(duì)人體組織造成傷害［22］.因此，在生物材料用于人體之前，要通過(guò)長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察，以期篩選出安全有效的可植入材料.

相比于其他絲素蛋白凝膠，本文所采用的新型絲素蛋白凝膠具有理想的注射性、穩(wěn)定性和力學(xué)性能，且前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明此凝膠材料具有止血防粘連、皮膚創(chuàng)面促修復(fù)、消炎去紅腫等功效.本文所采用的新型納微米孔支架則被體外實(shí)驗(yàn)證明是組織工程培養(yǎng)的良好載體，通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明是肌肉組織缺失修復(fù)、皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的良好填充和敷料材料.這兩類(lèi)材料均具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，因此深入研究其生物安全性和生物相容性具有重要的意義.

免疫系統(tǒng)在組織修復(fù)和重建中起核心作用［23］.生物材料與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用中，固有免疫系統(tǒng)的作用受到越來(lái)越多的重視.固有免疫是指機(jī)體生來(lái)就俱有的、抵抗外來(lái)病原體侵襲以及清除體內(nèi)抗原性異物的一系列防御能力.固有免疫細(xì)胞包括吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B1細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等［24］.

中性粒細(xì)胞是機(jī)體發(fā)生感染時(shí)首先到達(dá)炎癥部位的效應(yīng)細(xì)胞，具有較強(qiáng)的吞噬能力［24］.生物材料植入機(jī)體后，從外周血中招募的中性粒細(xì)胞被化學(xué)誘導(dǎo)因子激活，吸附到植入部位，通過(guò)蛋白水解酶和細(xì)胞質(zhì)顆粒釋放的活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及吞噬作用來(lái)降解生物材料［25］.另外，中性粒細(xì)胞在大型病原體的刺激下向細(xì)胞外釋放一種纖維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)［26］，即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs），在機(jī)體中起到降解毒力因子并殺滅細(xì)菌的重要作用［27］.過(guò)度產(chǎn)生的NETs會(huì)阻止生物材料和組織之間的相互融合，同時(shí)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)愈合過(guò)程的趨化因子被降解［28］，這就損害了愈合反應(yīng)和組織修復(fù)的潛力［29］.有研究通過(guò)消耗掉小鼠的先天免疫細(xì)胞后再植入生物材料，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞并不是纖維化的必須因素，而巨噬細(xì)胞才是增強(qiáng)纖維化反應(yīng)的因素［30］.

生物材料和巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究表明，在生物材料的包被和降解過(guò)程中，巨噬細(xì)胞不僅擔(dān)任抗原吞噬和提呈的角色，還起到促炎（M1）或抗炎（M2）的作用［31－32］，究竟是促炎作用還是抗炎作用，目前還尚無(wú)定論［32］，但是這一調(diào)控作用受生物材料的結(jié)構(gòu)和生物性能的影響［25，31］，生物相容性好的材料能夠輔助機(jī)體組織進(jìn)行功能重塑，而生物相容性差的材料則會(huì)在組織修復(fù)過(guò)程中形成炎癥、纖維化和瘢痕［31］.巨噬細(xì)胞能通過(guò)CXCL13使下游B細(xì)胞被招募聚集起來(lái)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)纖維化反應(yīng)［30］.樹(shù)突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，能夠激活免疫反應(yīng)，維持免疫耐受［33］，有效地刺激T和B淋巴細(xì)胞的活化，從而將固有免疫和適應(yīng)性免疫有機(jī)聯(lián)系起來(lái)［24］.

嗜酸性粒細(xì)胞在超敏反應(yīng)和寄生蟲(chóng)感染時(shí)被招募到炎癥或被感染部位，導(dǎo)致局部組織和外周循環(huán)中的嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多［24］.有研究表明T細(xì)胞通過(guò)在脫細(xì)胞支架中招募嗜酸性粒細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)IL-4的表達(dá)從而修復(fù)受損神經(jīng)［34］，嗜酸性粒細(xì)胞是這些支架中IL-4的主要來(lái)源，T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞通過(guò)高效地配合從而達(dá)到脫細(xì)胞支架修復(fù)受損神經(jīng)的目的.

嗜堿性粒細(xì)胞作為非吞噬性粒細(xì)胞，在炎癥和過(guò)敏反應(yīng)中起重要作用.當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)會(huì)非特異性地分泌大量的IL-4和IL-13，從而觸發(fā)機(jī)體Th2類(lèi)免疫應(yīng)答［24］.有研究顯示對(duì)聚砜膜血液透析材料過(guò)敏患者急性期樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒增加，表明嗜堿性粒細(xì)胞在機(jī)體的超敏反應(yīng)中被激活［35］.

B細(xì)胞和T細(xì)胞屬于適應(yīng)性反應(yīng)系統(tǒng)［25］.B細(xì)胞分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞兩個(gè)亞群，B1細(xì)胞可產(chǎn)生天然IgM［24］.B細(xì)胞能夠分泌抗體和細(xì)胞因子，從而抵御感染、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；B細(xì)胞還有產(chǎn)生記憶細(xì)胞和激活T細(xì)胞的功能［36］.T細(xì)胞作為適應(yīng)性反應(yīng)系統(tǒng)最重要的成員［23］，在被激活時(shí)以及炎癥狀態(tài)下都非常的靈活，T細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，通過(guò)對(duì)外周組織進(jìn)行巡視從而為機(jī)體提供免疫檢查［37］.當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，Toll樣受體（tolllike receptors，TLRs）通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB或干擾素調(diào)節(jié)因子來(lái)識(shí)別損傷信號(hào)，從而激發(fā)炎癥反應(yīng).TLRs激活組織中的巨噬細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)因子的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子的生成［23］.

理想的生物材料應(yīng)該具有減少宿主中性粒細(xì)胞的激活、優(yōu)化M1到M2巨噬細(xì)胞極化、Th1向Th2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、Treg細(xì)胞誘導(dǎo)［25］、控制免疫細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等特性［38］.

本研究首先采用基本的生物相容性實(shí)驗(yàn)如溶血實(shí)驗(yàn)、熱源實(shí)驗(yàn)、皮膚刺激和皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)等對(duì)絲素凝膠和絲素支架進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià).溶血實(shí)驗(yàn)用于在體外測(cè)定由材料浸提液導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白釋放的程度［17］，以評(píng)價(jià)材料對(duì)紅細(xì)胞功能和代謝的影響.根據(jù)我國(guó)《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》（GB／T16886.4-2003），合格判定指標(biāo)一般規(guī)定溶血率＜5%.本實(shí)驗(yàn)中絲素凝膠和絲素支架的溶血率分別為4.239%和2.312%（均＜5%），證明此兩種新型生物材料不引起溶血反應(yīng)，并且對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯的影響.致熱性是某種化學(xué)制劑或其他能產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)物質(zhì)的一種特性，致熱性反應(yīng)可能是由材料介導(dǎo)、內(nèi)毒素介導(dǎo)或其他物質(zhì)所介導(dǎo).其原理是由于內(nèi)毒素、病毒、細(xì)菌及其他微生物、類(lèi)固醇或某些材料釋放的熱源物質(zhì)等，作用于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，促使其產(chǎn)生內(nèi)生性熱源，作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，結(jié)果使動(dòng)物體溫上升［17］.熱源實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大白兔體溫升高均在0.6℃以下，3只升溫總和在1.4℃以下，符合生物材料的應(yīng)用要求.皮膚刺激實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)材料是否具有潛在的皮膚刺激作用［17］，皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)價(jià)材料是否具有潛在的非特異性急性毒性刺激作用［17］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明絲素凝膠和絲素支架對(duì)皮膚均無(wú)刺激反應(yīng).

本研究創(chuàng)新之處在于通過(guò)體內(nèi)植入絲素凝膠和絲素支架，采用分子免疫學(xué)評(píng)價(jià)方法，評(píng)估所植入的凝膠和支架是否引起免疫反應(yīng)如抗體水平升高、炎性細(xì)胞因子升高、免疫細(xì)胞異常活化.分子免疫學(xué)評(píng)價(jià)方法目前不在我國(guó)《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》（GB／T16886.4-2003）范圍內(nèi)，但是對(duì)于評(píng)價(jià)低免疫原性材料或人工器官的體內(nèi)植入導(dǎo)致的免疫排斥反應(yīng)非常重要，因?yàn)槟承┎牧想m然具有較好的生物相容性，但植入后會(huì)產(chǎn)生慢性炎癥，進(jìn)而影響移植效果，導(dǎo)致副作用的發(fā)生.

本研究利用小鼠作為體內(nèi)植入絲素凝膠和絲素支架的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用液相芯片法分析植入后5周小鼠血清中23種炎性細(xì)胞因子質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，證明絲素凝膠和絲素支架的體內(nèi)植入不會(huì)引起慢性炎癥，不會(huì)引起炎性細(xì)胞因子的升高；通過(guò)流式細(xì)胞法分析了凝膠和支架植入后對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞活化的影響，我們分析了脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中12類(lèi)免疫細(xì)胞的活化，發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、B1細(xì)胞、B1a細(xì)胞、B2細(xì)胞、CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞均未產(chǎn)生異常活化，其細(xì)胞分布水平在實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組中無(wú)顯著性差異；由于抗體水平是檢測(cè)是否產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)的主要表現(xiàn)，我們檢測(cè)了小鼠血清的總IgG和IgM，發(fā)現(xiàn)兩種材料在植入一周的測(cè)試中均未引起抗體水平升高，在植入5周后，只有絲素凝膠引起了總IgG的升高，通過(guò)分析該時(shí)間段的炎性細(xì)胞因子水平和免疫細(xì)胞激活狀況，證明僅有總IgG升高并不能表示引起了慢性炎癥反應(yīng)，至于IgG水平增高的原因，將在后續(xù)研究中探討.綜合而言，絲素凝膠和絲素支架不會(huì)引起異常免疫反應(yīng).

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)植入的綜合評(píng)價(jià)，表明絲素凝膠和絲素支架具有良好的生物相容性和低免疫原性.

作者貢獻(xiàn)聲明

石娜：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，完成實(shí)驗(yàn)操作，撰寫(xiě)論文；賀倫：完成實(shí)驗(yàn)操作；牛海濤：提出研究思路和框架，修改論文.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，石娜、賀倫、牛海濤與蘇州絲美特生物技術(shù)有限公司不存在潛在利益沖突.