季紅福，趙雯雯，王丹洪，鄭文豪，肖竹錢，戴靜，王永江*，毛建衛(wèi),2*

1(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化 制造協(xié)同中心，浙江 杭州，310023)2(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興，312000)

食鹽是人類日常飲食中可不或缺的成分，不僅可以維持細(xì)胞滲透壓，還可以改善高血壓，肥胖等各類疾病[1]。竹鹽作為一種食用鹽，是將日曬海鹽放入竹段中，用天然無污染的黃土封蓋，以松枝為燃料，在800～1 000 ℃高溫下煅燒，最終獲得的灰白色的固體鹽[2]。經(jīng)過高溫煅燒，竹鹽與竹筒、黃土中的礦物元素充分融合，使得其中金屬元素(如鈣、硅、鉀、鎂、鐵、鋅、硒等)的種類和含量均高于普通食鹽，因而具備一些普通食鹽沒有的功能。金屬微量元素是人體所必需的，對人體的生理健康起到重要作用。對現(xiàn)代中藥藥理活性物質(zhì)的研究表明，人體的一些疾病與金屬微量元素的失衡有關(guān)，一旦超過或者低于平衡水平，可能會引發(fā)人體疾病[3]。

淡竹葉是禾本科多年草本植物，具有清熱解毒、消痰、去煩熱、利小便等功效。研究表明，淡竹葉較其他竹葉，含有豐富的鉀、鎂、鈣、鐵、錳等元素[4]，以淡竹葉為載體，代替?zhèn)鹘y(tǒng)竹筒，采用竹鹽的工藝制備淡竹葉鹽，將淡竹葉中一些無機(jī)成分溶入原鹽中，得到富含礦物元素的食用鹽，也可作為竹葉開發(fā)應(yīng)用的一個(gè)方向。目前，淡竹葉鹽的研究鮮有報(bào)道。

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種代謝應(yīng)激性肝損傷，主要表現(xiàn)為脂肪酸等脂質(zhì)物質(zhì)過度積累。隨著人類生活水平的提高，越來越多的人受到NAFLD的影響，且人數(shù)隨著肥胖、Ⅱ型糖尿病和代謝綜合征的流行而增多[5]。研究表明，炎癥應(yīng)激會改變肝臟脂質(zhì)的平衡，導(dǎo)致過量的脂質(zhì)積累在肝臟中，是誘發(fā)NAFLD的重要分子機(jī)制。NAFLD患者往往肝臟中游離的脂肪酸水平較高，容易刺激肝臟局部促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這可造成NAFLD逐步演變成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌[6]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道，竹鹽具有抗氧化[7-8]，抗炎[9-10]、抑菌[11-12]、保護(hù)肝臟[13-15]，治療胃腸道疾病[16]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[17-18]及抗皮膚衰老[19-20]等功效。因此，本研究采用竹鹽制備工藝，用淡竹葉代替竹筒，得到淡竹葉鹽，與原鹽、精制海鹽和傳統(tǒng)竹鹽進(jìn)行比較研究，探究淡竹葉鹽在基礎(chǔ)理化性質(zhì)、抗炎以及抗肝癌方面的活性，為新型竹鹽產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗海鹽、精制海鹽、一次煅燒竹鹽，浙江臨安三和園竹鹽食品有限公司；淡竹葉鹽，實(shí)驗(yàn)室制備；淡竹葉，丹貝爾生物科技有限公司；3年生竹段，杭州市小和山國家森林公園；濃鹽酸、乙酸、無水乙醇，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；MEM(minimum essential medium)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人正常肝細(xì)胞(WRL68)，武漢普諾賽生命科技有限公司；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)，德國BIOFROXX公司；中性紅染色液、Griess試劑盒、BCA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；RAW264.7細(xì)胞，上海富衡生物科技有限公司。

pHS-3C精密酸度計(jì)，杭州齊威儀器有限公司；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司；Avio 200 ICP-OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀,美國PerkinElmer公司；BB150二氧化碳培養(yǎng)箱、MSC-AdvantageTMA2型II級生物安全柜，美國Thermo Fisher Scientific公司；CKX53倒置顯微鏡，日本Olympus公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 淡竹葉鹽的制備

將淡竹葉與粗海鹽按質(zhì)量比1∶9混合均勻放入坩堝中，用高溫管式爐加熱到850 ℃，升溫程序?yàn)? ℃/min，保溫2 h，冷卻至室溫后，取出坩堝，得到淡竹葉鹽。

1.2.2 鹽的理化性質(zhì)分析

pH測定。用超純水準(zhǔn)確配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%、0.5%、1%、2.5%和5%的粗海鹽、精制海鹽、一次煅燒竹鹽和淡竹葉鹽溶液。在25 ℃下，采用pHS-3C精密酸度計(jì)測定其pH值。

礦物元素分析。準(zhǔn)確稱取0.50 g竹筒灰、淡竹葉灰和4種鹽樣品于樣品瓶中，加入2.5 mL濃鹽酸和2.5 mL超純水，在90 ℃下進(jìn)行硝化處理2 h，稀釋200倍配制成溶液，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES)測定溶液中Na、K、Ca、Mg、Fe、Al、P、Se、Sr元素含量。

1.2.3 鹽對小鼠巨噬細(xì)胞炎癥的抑制作用

RAW264.7培養(yǎng)。RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳至3代后，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后移至96孔板中(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)孵育至對數(shù)生長期，分組實(shí)驗(yàn)。

鹽樣品對細(xì)胞生長毒性的測定。實(shí)驗(yàn)分組：配制最終樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。在96孔板中加入混合均勻的細(xì)胞懸浮液100 μL(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)基，按上述分組加入100 μL鹽樣品溶液，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，空白對照組只加完全培養(yǎng)基。采用MTT法測定不同濃度樣品對細(xì)胞存活率的影響。

細(xì)胞炎癥模型建立。實(shí)驗(yàn)分組：配制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2、4 mg/L的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。在24孔板中加入混合均勻的細(xì)胞懸浮液1 mL(每孔1×105個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)基，按上述分組加入1 mL鹽樣品溶液，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，空白對照組只加完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用Griess試劑盒測定上述細(xì)胞上清液的NO含量，選擇NO釋放量與對照組有顯著性差異的LPS濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

鹽樣品對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力測定。在96孔板中加入混合均勻的細(xì)胞懸浮液100 μL(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，在5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分組實(shí)驗(yàn)，每組6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組(不加樣品干預(yù)處理)、LPS組(1 mg/L)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的粗海鹽、精制海鹽、竹鹽和淡竹葉鹽組，空白對照組(只加DMEM完全培養(yǎng)基)。移去培養(yǎng)基，按上述分組加入100 μL鹽樣品溶液，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，空白對照組只加完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24 h后棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))中性紅染色液，孵育1 h后棄去中性紅染色液，用PBS潤洗2遍，加入100 μL已配好的細(xì)胞裂解液(50%乙酸-50%無水乙醇，體積比1∶1)，振蕩儀振蕩30 min，靜置2 h后，在540 nm處測定其吸光值，計(jì)算各組細(xì)胞吞噬指數(shù)。細(xì)胞吞噬指數(shù)計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A表示細(xì)胞吞噬指數(shù)，%；A0表示空白對照組吸光度；A1表示樣品組吸光度。

鹽樣品對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量和細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β含量測定。在24孔板中加入混合均勻的細(xì)胞懸浮液1 mL(每孔1×105個(gè)細(xì)胞)，在5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分組實(shí)驗(yàn)，每組3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組(不加樣品和LPS干預(yù)處理)、LPS組(1 mg/L)、LPS(1 mg/L)+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的粗海鹽、精制海鹽、竹鹽和淡竹葉鹽組，空白對照組(只加DMEM完全培養(yǎng)基)。棄去培養(yǎng)基，按上述分組加入1 mL鹽樣品溶液，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，空白對照組只加完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集細(xì)胞上清液，采用Griess試劑盒測定不同樣品對RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量，采用TNF-α、IL-1β試劑盒測定上清液中TNF-α、IL-1β的含量。收集上清液，加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞核蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定每孔蛋白含量。

1.2.4 鹽對肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞增殖、凋亡的作用

HepG2/WRL68培養(yǎng)。HepG2/WRL68細(xì)胞復(fù)蘇后，分別用含10%胎牛血清的MEM/DMEM培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳至3代后，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后移至96孔板中(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)孵育至對數(shù)生長期，分組實(shí)驗(yàn)，每組6個(gè)復(fù)孔。

MTT法檢測細(xì)胞存活率。在96孔板中加入混合均勻的HepG2/WRL68細(xì)胞懸液100 μL(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL終鹽樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的細(xì)胞培養(yǎng)基，空白對照組只加完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用MTT法測定不同濃度樣品對細(xì)胞存活率的影響。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)和處理方法同上述方法，收集用0.6%鹽樣品濃度處理的細(xì)胞，用PBS洗2次，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5～10萬重懸的細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，立即用流式細(xì)胞儀檢測，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用方差進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)P<0.05，Origin 8.0軟件制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦物元素分析

礦物元素分析如表1所示，淡竹葉與竹段相比，含有更為豐富的K、Ca、Mg元素，故淡竹葉鹽中的K、Ca、Mg含量也略高于竹鹽，而竹鹽和淡竹葉鹽中K、Ca、Mg、Fe、Se、Sr等含量均高于粗海鹽和精制海鹽，說明竹鹽和淡竹葉鹽通過竹鹽工藝的高溫煅燒，其礦物質(zhì)的種類增多、礦物質(zhì)的含量提高。在粗海鹽和精制海鹽中分別檢測出質(zhì)量濃度為0.061和0.003 mg/L的Pb，而竹鹽和淡竹葉鹽并沒有檢測出Pd。嚴(yán)雅麗等[20]研究表明經(jīng)過高溫煅燒的新型功能性植物鹽，均具有豐富的元素組成，且重金屬Pd的含量顯著低于原鹽，說明高溫煅燒工藝還可以降低重金屬污染以及各類有機(jī)污染物等風(fēng)險(xiǎn)。

表1 竹段、竹葉和各類鹽的礦物質(zhì)元素含量比較Table 1 Comparison of mineral element contents of bamboo section, bamboo leaf and various salt

2.2 pH分析

根據(jù)不同鹽樣品的酸堿性(圖1)可知，在低濃度(0.25%～0.5%)下，4種鹽的pH值均小于7，呈弱酸性；在高濃度下，粗海鹽和精制海鹽溶液的pH仍呈弱酸性，在0.25%～5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，竹鹽和淡竹葉鹽的pH值與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，且在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，竹鹽和淡竹葉鹽的pH明顯呈堿性，這是由于竹鹽和淡竹葉鹽是由粗海鹽通過竹鹽工藝高溫煅燒而成，含有一定量的竹子和淡竹葉灰燼，因而其含有一定量的碳酸根離子，導(dǎo)致其在高濃度條件下呈弱堿性。陳湄沁[22]研究表明，5%的鹽濃度下，竹鹽的pH值為11.0，而原鹽為6.0，兩者pH值相差顯著，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。血液的pH值對人體健康是非常重要的，正常人體血液的pH值約為7.4，呈弱堿性。適當(dāng)以淡竹葉鹽代替?zhèn)鹘y(tǒng)海鹽可以中和人體內(nèi)多余的酸，如胃酸，對保持人體血液酸堿平衡具有一定的作用。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的各類鹽的pHFig.1 pH of various salt with different concentrations

2.3 鹽樣品對RAW264.7細(xì)胞炎癥的作用

2.3.1 鹽樣品濃度對RAW264.7細(xì)胞毒性和吞噬能力的影響

鹽樣品濃度對RAW264.7細(xì)胞毒性如圖2-A所示，通過MTT檢測，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的鹽樣品作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，與對照組相比，細(xì)胞活力無顯著性差異。而隨著鹽樣品濃度增加，RAW264.7細(xì)胞的存活率與鹽樣品濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因?yàn)殡S著鹽濃度增大，細(xì)胞培養(yǎng)基中的滲透壓也會增加，從而影響細(xì)胞生長，故選擇0.1%鹽樣品濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。鹽樣品濃度對RAW264.7吞噬能力的影響如圖2-B所示，LPS組和不同鹽樣品組均能顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力；粗海鹽組與精制海鹽組對RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力無顯著性差異，竹鹽組和淡竹葉鹽組對RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力無顯著性差異，但與粗海鹽組、精制海鹽組相比，其對RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力存在顯著性差異。上述結(jié)果表明竹鹽和淡竹葉鹽能更有效增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。

A-細(xì)胞毒性；B-吞噬能力圖2 鹽樣品濃度對RAW264.7細(xì)胞的影響(n=6)Fig.2 Effect of salt sample concentration on RAW264.7 cells(n=6)注：與對照比較，不同字母表示在相同濃度下差異顯著(P<0.05)

2.3.2 LPS濃度對RAW264.7細(xì)胞釋放NO含量的影響

用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥是一種常用的細(xì)胞炎癥模型[23]。如圖3所示，通過Griess試劑盒檢測，0.25～4.00 mg/L的LPS作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，與對照組相比，其NO釋放量均有極顯著性差異，說明建模成功。參考林楊等[24]的研究，最終選擇1 mg/L的LPS濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 LPS濃度對RAW264.7細(xì)胞釋放NO含量的影響(n=3)Fig.3 Effect of LPS concentrations on NO production in RAW264.7 cells(n=3)注：不同字母表示與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組存在顯著差異(P<0.05)

2.3.3 鹽樣品對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥中NO、TNF-α和IL-1β含量的影響

當(dāng)LPS對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生刺激時(shí)，RAW264.7細(xì)胞會被激活，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO和炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等，測定炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的含量是評價(jià)炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[25]。由圖4-A可知，與對照組相比，LPS組RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量顯著提高(P<0.01)。0.1%粗海鹽和精制海鹽組與LPS組對RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量無顯著影響(P>0.05)，而同濃度的竹鹽和淡竹葉鹽組可顯著降低RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量(P<0.05)，說明了竹鹽和淡竹葉鹽都具有一定的抗炎作用。由圖4-B、4-C可知，LPS模型組中TNF-α、IL-1β的含量顯著高于對照組(P<0.05)。0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的粗海鹽和精制海鹽組與LPS模型組相比， RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的含量無顯著性差異，而同質(zhì)量濃度的竹鹽和淡竹葉鹽組可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的含量(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：竹鹽和淡竹葉鹽可通過下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的含量而起到抗炎作用。LEE等[10]的研究表明竹鹽可以顯著降低人牙齦成纖維細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表達(dá)，從而起到抗炎的作用，緩解口腔炎癥，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。研究表明，高鹽飲食會誘發(fā)高血壓和心血管疾病[26]，而本實(shí)驗(yàn)采用鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，攝入量小，符合我國推薦每日鹽攝入量(6 g/d)，且又具有一定的抗炎功效，適當(dāng)以淡竹葉鹽代替?zhèn)鹘y(tǒng)食用鹽可能在國民健康中具有較好的應(yīng)用前景。

A-NO;B-TNF-α;C-IL-1β圖4 鹽樣品對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的影響(LPS 1 mg/L、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)(n=3)Fig.4 Effect of salt sample on LPS induced secretion of inflammatory factors in RAW264.7 cells(LPS 1 mg/L、 salt concentration 0.1%)(n=3)注：*表示與LPS組比較，實(shí)驗(yàn)組存在顯著差異(P<0.05)，**表示與LPS組比較，實(shí)驗(yàn)組存在極顯著差異(P<0.01)，不同字母表示 在相同濃度下差異顯著(P<0.05)

2.4 鹽樣品濃度對肝細(xì)胞增殖、凋亡的作用

2.4.1 鹽樣品濃度對HepG2/WRL68增殖的影響

鹽樣品對HepG2/WRL68增殖的影響如圖5所示，由圖5可以看出，在鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.8%時(shí)，隨著鹽濃度增加，4種鹽樣品對于HepG2/WRL68細(xì)胞抑制率呈濃度依賴關(guān)系，在高濃度下，其樣品對HepG2/WRL68細(xì)胞有很大的毒性。對于HepG2細(xì)胞，在0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，粗海鹽組和精制海鹽組存活率為75%左右，而竹鹽組和淡竹葉鹽組存活率分別為66%和62%。對于WRL68細(xì)胞，在同0.6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，粗海鹽和精制海鹽組存活率為80%左右，竹鹽和淡竹葉鹽組存活率為88%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，竹鹽和淡竹葉鹽的抑制肝癌增殖效果優(yōu)于粗海鹽和精制海鹽，而對于正常肝細(xì)胞的保護(hù)作用高于粗海鹽和精制海鹽。

A-HepG2細(xì)胞；B-WRL68細(xì)胞圖5 不同鹽樣品對HepG2/WRL68的毒性影響Fig.5 Toxic effects of different salt samples on HepG2/WRL68 cells

2.4.2 鹽樣品對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

由2.4.1可知，在高濃度下(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%)，鹽樣品均對HepG2細(xì)胞有很大的毒性，而在低濃度下(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.4%)，鹽樣品對HepG2細(xì)胞存活率的影響較弱，故選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽樣品處理細(xì)胞。如圖6所示，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽樣品作用HepG2細(xì)胞24 h后，與正常對照組相比，淡竹葉鹽組可以顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，且促凋亡效果優(yōu)于竹鹽組、粗海鹽組和精制海鹽組。由圖7可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽樣品作用HepG2細(xì)胞24 h后，淡竹葉鹽的總凋亡率為(45.85±2.93)%，高于竹鹽組[(38.89±2.56)%]、粗海鹽組[(31.78±4.18)%]和精制海鹽組[(29.63±1.89)%]；其中，淡竹葉鹽主要影響肝癌細(xì)胞的早期凋亡，竹鹽主要影響肝癌細(xì)胞的晚期凋亡。PARK等[27]研究表明竹鹽對HepG2細(xì)胞具有較好的抗癌作用且高于同濃度原鹽和精制鹽，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。YI等[18]研究表明不同煅燒次數(shù)的竹鹽對抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤增殖效果存在顯著差異，其中九烤竹鹽增殖抑制效果優(yōu)于三烤竹鹽、一烤竹鹽，且不同煅燒次數(shù)的竹鹽均高于精制食鹽和原鹽，說明竹鹽中的微量元素含量與其生理活性具有密切相關(guān)的聯(lián)系。

A-對照;B-0.6%粗海鹽;C-0.6%精制海鹽;D-0.6%竹鹽;E-0.6%淡竹葉鹽圖6 不同鹽樣品對HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of different salts on apoptosis of HepG2 cells

2.4.3 鹽樣品對WRL68細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)2.4.2，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽樣品處理WRL68細(xì)胞。由圖8可知，與正常對照組相比，竹鹽組和淡竹葉鹽組對WRL68細(xì)胞的凋亡率遠(yuǎn)低于粗海鹽組和精制海鹽組，說明竹鹽和淡竹葉鹽的抑制凋亡效果更加顯著，可以抵制 WRL68細(xì)胞的凋亡，保護(hù)正常肝細(xì)胞的生長。由圖9可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽樣品作用肝細(xì)胞24 h后，與對照組相比，淡竹葉鹽組的細(xì)胞存活率[(83.67±2.72)%]顯著高于竹鹽組[(81.56±2.37)%]、粗海鹽[(75.57±2.20)%]和精制海鹽[(77.35±3.49)%]，表明在高鹽濃度下，淡竹葉鹽對正常肝細(xì)胞損傷程度低于粗海鹽、精制海鹽和精制海鹽。ZHAO等[28]的研究表明竹鹽可以顯著降低肝損傷的大鼠血清中天門冬氨酸氧基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，降低大鼠的肝臟組織的受損程度，說明竹鹽對肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

A-對照；B-0.6%粗海鹽；C-0.6%精制海鹽；D-0.6%竹鹽；E-0.6%淡竹葉鹽圖8 不同鹽樣品對WRL68細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effect of different salts on apoptosis of WRL68 cells

A-細(xì)胞存活率;B-早期凋亡率;C-晚期凋亡率;D-總凋亡率圖9 不同鹽樣品對WRL68細(xì)胞凋亡率的影響(n=3)Fig.9 Effect of different salts sample on apoptosis rate of WRL68 cells(n=3)

3 結(jié)論

研究采用竹鹽制備工藝制備淡竹葉鹽，比較研究了粗海鹽、精制海鹽、傳統(tǒng)竹鹽和淡竹葉鹽的pH、礦物元素含量等理化指標(biāo)，分析了4種鹽的抗炎效果及抑制肝癌細(xì)胞的效果。結(jié)果表明：淡竹葉鹽呈弱堿性，礦物元素組成豐富，尤其是K、Ca、Mg含量較高?？寡讓?shí)驗(yàn)結(jié)果表明：淡竹葉鹽能顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力，抑制NO釋放以及降低TNF-α、IL-1β分泌。抑制肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：淡竹葉鹽對肝癌細(xì)胞的抑制增殖作用顯著強(qiáng)于粗海鹽、精制海鹽和竹鹽；在高鹽濃度下，其對正常肝細(xì)胞保護(hù)作用高于粗海鹽、精制海鹽和竹鹽；因此淡竹葉鹽在品質(zhì)上優(yōu)于粗海鹽、精制海鹽和竹鹽。同時(shí)淡竹葉鹽中K含量較高，可以減少鈉的吸收，預(yù)防高血壓等慢性病。由于人類的健康與鹽的攝入具有重要的關(guān)系，以淡竹葉鹽為例的新型功能性鹽的開發(fā)與探究都具有重要的意義。若在人們飲食中用新型功能性鹽代替部分普通食鹽，將會對國民健康起到積極作用。